Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину G павианов Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть применено в медико-биологических исследованиях, например, для опреде{1ения иммуноглобулинов G у павианов.,

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мон-Ар, направленные к классоспецифическрй детерминанте IgG павианов. Это позволит проводить прямое сравнение данных, полученньгх на павианах, с результатами, найденными у человека, что крайне важно при моделировании ряда заболеваний человека на обезьянах.,

Штамм гибридных клеток ПГСЗ| (гибридома) получают путем слияния мышиной миеломы Х63-А. 8,653 с клетками селезенки мыши BALB/C, иммунизированной IgG павиана-гамадрила. Отбор продуцирующих МКА клонов на первом этапе проводят с помощью igG павиана-гамадрила. Наиболее реактивные клоны тестируют на реактивность с IgG других видов рода павианов: анубиса (рар)о anubis) и гвинейского павиана (papio papio) Гидридому, имеющую одинаковую реактивность с IgG этих видов, проверяют в вестерн-блотинге на секрецию МОН-АТ против тяжелых цепей IgG павианов. Далее гибридома прошла три этапа клони рования методом предельных разведений. Штамм nrGt депонирован в,коллекцию Института Цитологии АН СССР. Ниже дается характеристика штамма гибридомы:

1.Регистрационный номер ВСКК(П) 376Д, авторское наименование штамма: ПГС|.

2.Причины депонирования: продуцент моноклональных антител против IgG павианов.

3.Д Родословная штамма:

Клетки миеломы Х63-Ад 8.653 + клетки селезенки мыши BALB/c, иммунизированной IgG павиана-гамадрила, сливающий агент - ПЭГ 6000, селекция клеток на среде HAT, 3 клонирования методом предельных разведений (1 клетка/3 лунки).

4.Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 7.

5.Стандартные условия выращивания: Среда RPMI - 1640 + 15% FCS, 37°С,

газовая фаза - воздух + 5% С02.

6.Культуральные свойства:

способ культивирования - встеклянных или пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза - 500.000 клеток/мл, кратность рассева - 1ч2, время субкультивирования 3-4 дня.

7.Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: мышь BALB/C, обработанная приставом /1 мл, в/б за 10 дней до инокуляции/, доза инокуляции -.5-10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

,8. Данные по видовой принадлежности: мышиные клетки линии BALB/c.

9.Маркерйые признаки и методы их оценки:

гибридома секретирует Мон-АТ против тяжелых цепей IgG павианов, определяемые иммуноферментными, иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими методами..

10.Контроль контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами:

.контаминации бактериями, грибами и микроплазмы нет.

Один из родительских клеток продуцируют эндогенный ретровирус С-типа мышей.

11.Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом: мон-АТ IgG класса, направленные к классоспецифической детерминанте тяжелых цепей, IgG павианов: специфичность оценивалась иммуноферментным методом и вестернблотингом.

12.Концентра1дия полезного продукта (моноклональных антител) в среде около 10 мкг/мл, в асцитиой жидкости около Юмг/мл.

Титры данных антител при определении с помощью твердоазного иммуноферментf

ного метода около 2x10 (среда/ и 2х10-6/асцит при концентрации антитена 1 мкг/мл. Определение антител можно проводить также иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими методами. Продукция моноклональных антител стабильна, по крайней мере, в течение 9 пассажей in vitro.

13. Способ криоконсервации:

0 5-6 млн клеток в FCS + 10% DMSO, программное замораживания около 90% (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего).

Использование штамма илюстрируется

5 следующими примерами:

П р и м е р 1. Сыворотки трех видов, павианов (анубиса. гвинейского и гамадрила) используют для приготовления 2-кратных разведений, начиная с 1:2000. В лунке

0 96-луночных пластинок для твердофазного иммуноферментного анализа вносят приготовленные разведения сывороток обезьян. Параллельно используют такие же разведения сыворотки человека. При этом происходит сорбция белков сыворотки на пластине лунок. Несвязавшиеся белки удадяют, свободные адсорбционные точки блокируют 8%-ным раствором сухого обезжиренного молока, после чего в лунки вносят разведение либо асцитной жидкости Мон-АТ ПГСк либо прототип - мон-АТСз (1:2000). После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промываютдля удаления несвязавщихся антител, вносят антимышиный коньюгат,

5 меченный пероксидазой, и проводят стадии инкубации и отмывки. Затем в лунке добавляют раствор о-фенилендиамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превращает в окрашенное соедине0 ние. Степень окраски, измеренная при 492

нм, пропорциональна концентрации IgG в

сыворотке. Из получаемых результатов сле дует, что мон-АТ nfGI одинаково хорош.о

реагирует с IgG всех трех видов павиата и

5 человека. Отношение оптических плотностей для разведения 1:4000 при 492 нм, полученных на сыворотках павианов. к оптической плотности, полученной на сыворотке человека, при использовании мон-АТ

0 nrGi равны 0,97:0,85, 1,39 (среднее 1,04), тогда как МКА Gs хорошо реагирует с сывороткой человека, но практически не реагирует с сыворотками павианов. Отношение, близкое к единице, позволяет проводить

5 прямое сравнение данных, полученных при. определении антител IgG класса у павианов, с результатами, полученными у человека.

П р и м е р 2. Навески IgG трех видов павианов и человека в количестве 10 мкг каждого на трех кипятят в течение 5 мин на

водяной бане в буфере для образцов, содбржащем мер - каптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей и при электрофорезе иммуноглобулиннразделяют на тяжелые и легкие цепи. Белки элюируются электропереносом на нитроцеллюлозу, которую инкубируют в 8%-ном растворе сухого молока для блокирования свободных адсорбционно-ак ивных точек. Определение ведут в двух параллельнь хрбразцах. Первую половину инкубирукл с мон-АТ Сз (прототип), а вторую с ПГС| (1:500) в течение 2 ч при . После отмывки несвязавшихся антител нитроцеллюлозу инкубируют и повтор 2 ч при 37°С с антимышиным конъюгатом, меченным nfроксидазой, и повторяют отмывку. Пе|31оксидаза в присутствии перекиси водорода

переводят субстрат-диаминобензидин в окрашенное соединение, причем только в том месте, где Мон-АТ взаимодействует со своим антигеном. В данном случае, прототипМон-АТ Сз, реагирует с тяжелыми цепями только IgG человека, тогда как предлагаемое Мон-АТ ПГС| реагирует с тяжелыми цепями человека и всех трех видов павианов. Полученные результаты показывают, .

что в отличие от прототипа, Мон-АТ ПГСг направленно к кпассосг ецифической детерминанте, общей для тяжелых цепей IgG павианов и человека.

«В о р м у л а и 3 о б р е т е н и я

Штамм гибридных культивируемых кле ток животнь х Mus musculus, L. ВСКК(П) Nfe 376 Д-продуцентмоноклональных антител к иммуноглобулину G павианов.