Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы Советский патент 1989 года по МПК C12N11/08 

1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению иммобилизованных ферментов, и может бытьv использовано в п цевОй промышленности.;

Целью-, изобретения является увеличение активности и стабильности иммобилизованной глюкоамилазы.

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы заключается в повышенном связывании глюкоамипазы с помощью водорастворимого карбодиимида с синтетическим носителем на основе акрнламида, в качестве носителя ис- пользуют пористые гранулы из сополимера акриламида, К,Ы -метиленбисакг риламида и К-(аминоэтил)акриламида, содержащего 2,75 Мэкв/г Ш -групп, или из сополимера акриламрща, N,N - метиленби сак рил амида и акриловой кислоты, содержащего 1,0-7,49 Мэкв/г СООН-групп, размер пор которых не позволяет проникать в них веществам с мол.м. 100.000-300.000 дальтон, а связьшание проводят при рН 4,5-9,0, температуре в течение 24-72 ч, полученньй гель промывают буфером, неоднократно отмьгеают от солей водой и при желании лиофилизуют. Спо- .соб позволяет получить препараты

4

О)

СО Ч

СО

ы

иммобилизованной глюкоамилазы с высокой стабильностью ихактивностью.

Пример 1. 0,5 г Akrilex А ксерогеля (связьшающая способность, т.е. содержание NH -групп 2,75 Мэ кв/г размер частиц 100.320 мкм) суспендируют в 25 мл 0,1 М к-фосфаты (рН 7,0), добавляют 1,7 мг раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) при перемешивании. Через 10 мин добавляют 0,5 г Ы-циклогексил-к -Г2-(4-морфо- линш1)этил 7-карбодиимида, растворенного в 25 мл холодного буфера (+4 с) При полное время реакции составляет до 48 ч, за это время смесь перемешивают два раза по 6 ч. Гель отделяют фильтрованием и трижды про- мьшают 50 мл 0,1 М к-фосфата (рН 7,0), трижды тем же буфером с добавлением 1 M.NaCl (по 50 мл) и трижды по 50 мл буфера NaCl. Затем промьюа- ют дистиллированной водой и модифицируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной- глюкоам1 тазы с активностью 1,6 г глюкозы/ч Г ксерогеля.

Пример 2. 0,5г Akrilex С-100 ксерогеля (содержание СООН- групп 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100- 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 4,5) и добавляют Г г карбодиимида. Далее способ осуществляют по примеру 1, . заменяя к-фосфат на 0,1 М ацетат натрия с рН 4,5. Получают 0,7 . г иммобилизованной глюкоамилазы с активностью 0,85 г глюкозы/ч т ксерогеля.

Пример 3. Ведут опыт по примеру 2 за исключением того, что реакцию ведут 24 ч. Выход: 0,65 г иммоТбилизованной глюкоамилазы. Ак- тивность: высвобождается 0,79 г глюкозы/ч г ксерогеля.

Пример 4. Ведут опыт по примеру 2 за исключением того, что реакцию ведут в течение 72 ч. Выход: 0,63 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобозкдается , : 0,82 г глюкозы/ч«г ксерогеля.

Пример5. О,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая активность, т.е. СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 50 мл О,1 М буфера ацетата натрия (рН 5,0), после чего добавляют 1 г К-циклогексил- -N -Г2-(4-морфолинил)-этилЗ-карбоди- имид-метип-пара-тблуолсульфоната на

0

0

охлаждаемой льдом бане при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,6 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН per. акционной смеси устанавливают 4,5. При 0-4 С. полное время реакции составляет до 48 ч за это время суспензию дважды перемешивают в течение 6 ч каждый раз, рН контролируют в начале каждого получаса, а затем раз в час и в случае необходимости доводят до нужного значения. После за5 вершения реакции гель удаляют фильтрацией и трижды промывают порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 5,0), трижды порциями по 50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего 1,0 моль хлористого натрия, каждая (рН 5,0), и трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия ХрН 5,0). В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллирован5 ной ,водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г. иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: О,75 г,

П р и М е .р 6. 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связьшающая спо0 собность, т.е. СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия(рН 6,0}, после;, чего добавляют 1 г К-циклогексип-Ы g -f2-(4-морфолинил)-э тил -карбодиимид- -метил-пара-толуолсульфоната на водяной бане со.льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь пере- мешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 6,0. При 0- 4 С время до завершения реакции составляет до 48 ч, за это время сус- пенз.ию дважды перемешивают по 6 ч каждый раз, рН контролирзпот в начале каждого получаса и затем один раз в час, а в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промывают порциями по 50 мл 0,1 И буфера ацетата рия (рН 6,0), трижды порциями по :50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего 1,0 моль хлористого натч рия каждьй ,(рН 6,0), и тршсды.порци- ями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата I натрия (рН 6,0). В конце гель промы .вают , до полного удаления соли

0

5

0

5

дистиллированной водой и лиофилизи- руют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизированной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 1,35 г глю- ксзы/ч Г ксерогеля, Пример 7. 0.5г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая активность, т.е. СООН-содержание,

ток суспензию дважды перемешивают по 6 ч каждый раз, фН контролируют в начале каждого получаса, а позднее раз в час, в случае необходимости доводят до нужного значения. После .завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промьшают . порциями по 50 мл О,1 М буфера аце6,2 Мэкв/г, размер частиц 100-320мкм) ю тата натрия (рН 7,5), трижды порция- суспендируют в 50 мл 0,1 М буферами по 50 мл 1,0 М буфера ацетата наацетата натрия (рН 7,0), после чеготрия, содержащего по 1,0 хлористого

добавляют 1 г N-циклoгeкcил-N -Г2-(4- натрия каждая (рН 7,5), и трижды пор- -морфолинил)-этил -карбодиимид-ме- тил-пара-толуолсульфоната на бане с ледяной водой при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемециями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата 15 натрия (рН 7,5), В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофипизируют, в : результате получают 0,75 г иммобилизованного геля. Активность: вьщеля.шивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рП реакционной смеси устанавливают 7,0, При 0-4 С полное время реакции составляет до 48 ч, за это время суспензию перемешивают дважды по 6 ч каждый раз, рН

циями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата 15 натрия (рН 7,5), В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофипизируют, в : результате получают 0,75 г иммобилизованного геля. Активность: вьщеля20 ется 5,7 г глюкозы/ч«г ксерогеля. Пример 9, 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая активность, т,е, СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - контролируют в начале каждого по луч а-25 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М са, затем каждый час, а в случае не-буфера ацетата натрия, после чего

обходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют, фильтрованием и трижды промывают порциями по 50 МП О,1 М буфе- ЗО бане со льдом при постоянном пере- ра ацетата натрия (рН 7,0), триждымешивании. Реакционную смесь перемепорциями по 50 мл 1,0 М буфера ацета- шивают в течение 10 мин, после чего

добавляют 1 г К-циклогексия-К -L2- -(4-морфолинил)-этшь1-карбодиимчц- -пара-толуол-сульфоната в водяной

ток суспензию дважды перемешивают по 6 ч каждый раз, фН контролируют в начале каждого получаса, а позднее раз в час, в случае необходимости доводят до нужного значения. После .завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промьшают . порциями по 50 мл О,1 М буфера аце тата натрия (рН 7,5), трижды порция- ми по 50 мл 1,0 М буфера ацетата нанатрия каждая (рН 7,5), и трижды пор-

циями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 7,5), В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофипизируют, в результате получают 0,75 г иммобилизованного геля. Активность: вьщеля ется 5,7 г глюкозы/ч«г ксерогеля. Пример 9, 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая активность, т,е, СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия, после чего

бане со льдом при постоянном пере- мешивании. Реакционную смесь переме

добавляют 1 г К-циклогексия-К -L2- -(4-морфолинил)-этшь1-карбодиимчц- -пара-толуол-сульфоната в водяной

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению и использованию иммобилизованных фермек тов, в частности глшкоамилазы. Цель изобретения - повьшение активности и стабильности целевого продукта. Способ заключается в повышенном связывании с помощью водорастворимого карбодиимида глюкоамилазы. на сополимере акриламида, N,N -метиленбисак- риламида и К-(аминоэтил)акриламида, содержащего 2,75 м.экв/г - Ш -групп или из сополимера акриламида, N,N - метиленбисакриламида и акриловой кислоты, содержащего 1,0-7,49 м.экв/г (ЮОН-групп, размер пор которых не позволяет проникать в них веществам с мол.м. 100.000-300.000 дальтон. Связьюание проводят при рН 4,5-9,0, температуре в течение 24-72 ч. Способ позволяет повысить активность иммобилизованной глюкоамилазы в л. 4 раза, а также ее стабипьность в л. 3 раза. i О)

та натрия, содержас5его по 1,0 моль хлористого натрия (рН 7,0), и трижды порциями по 50 мл 0,1 К буфера ацетата натрия (рН 7,0), В конце гель промьшают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизи- руюТо Таким образом получают 0,6 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 3,0 г глюкозы/ч т ксерогеля.

Пример 8, 0,5г Akrile x С-100 ксерогеля (связьшаклцая ак- тивность, т.е, СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100.- 320 мкм) суспендируют в 50 мл Q,l М буфера ацетата натрия (рН 7,5), после чего добавляют 1 г N-циклогексил- -N -f2-(4-мopфoлинил)-этил -кapбoди- имид-мeтил-пapa-тoлyoлcyльфoнaтa в на водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глюко-

добавляют 1,7 мл раствора глюкоами лазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 8,0, При 0-4 С время до завершения реакции составляет до 48 ч, за этот промежуток суспензию дважды перемешиваю по 6 ч каждьй раз, рН контролируют

4Q в начале каждого получаса, а затем один раз в час, в случае необходимо сти доводят до нужного значения. П ле завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промьшают

дд порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,0), трижды порция ми по 50 мл 1,0 М буфера ацетата н рия , содержащего по 1,0 моль хлори того натрия каждьй (рН 8,0), и триж ды порциями по 50 мл 0,1 молярного буфера ацетата натрия (рН 8,0), В конце гель промьшают до полного уда ления соли дистиллированной водой и лиофилизируют, Таким образом, получают 0,65 г иммобилизованной глюко50

амилазы (117,7 мг/мл) и рН реакцион-амилазы. Активность: 3,9 г глюкозы ной смеси устанавливают до 7,5, При высвобождается/ч.г ксерогеля.

время до завершения реакции П р и м е р 10. составляет до 48 ч и за этот промежуПример 10. 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая способ

добавляют 1,7 мл раствора глюкоамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают 8,0, При 0-4 С время до завершения реакции составляет до 48 ч, за этот промежуток суспензию дважды перемешивают по 6 ч каждьй раз, рН контролируют .

Q в начале каждого получаса, а затем один раз в час, в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют . фильтрованием и трижды промьшают

д порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,0), трижды порциями по 50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия , содержащего по 1,0 моль хлористого натрия каждьй (рН 8,0), и трижды порциями по 50 мл 0,1 молярного буфера ацетата натрия (рН 8,0), В конце гель промьшают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют, Таким образом, получают 0,65 г иммобилизованной глюко0

амилазы. Активность: 3,9 г глюкозы высвобождается/ч.г ксерогеля.

П р и м е р 10.

Пример 10. 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связывающая способ7.146

ность, т.е. СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 40 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,5), после чего добавляют 1 г Н-циклогексил -Ы - (4-морфолинил)-этил -карбодиимид- -метил-пара-толуолсульфоната в бане с ледяной водой при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глюкоамила- зы (117,7 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают §,5. При 0-4 С время до завершения реакции состав- ляет до 48 ч., за это время суспензию перемешивают дважды по 6 ч кагвдый раз, рН контролируют в начале каждо- го получаса, а затем один раз в час, в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения .реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промывают порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 8,5), трижды по 50 мл 0,1 М буфера ацетат;а натрия, содержащего 1,0 моль хлори- стого натрия (рН 8,5), и трижды порциями по 50 мл 0,1 М ацетата натрия (рН 8,5). В конце гель промывают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизи- руют Таким образом, получают 0,7 г иммоб1&1изованной глюкоамилазы. Ак- .тивность: высвобождается 2,2 г глюко ксерогеля.

Пример 11. 0,5 г Akrilex С-I OO ксерогеля (связывающая способность, т.е, СООН-содержание, 6,2 Мзкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 9,0), после чего добавляют 1 г N-циклогексил- -к -Г2-(4-морфолинил)-этйл -карбоди- имид-метил-пара-толуолсульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин , после чего добавляют 1,7 мл раствора глю- коамилазы (117,7 мг/мп) и рН реакционной смеси устанавливают 9,0. При 0-4 с время до завершения реакции доставляет до. 48 ч, за этот промежуток суспензию -дважды перемешивают по 6 ч каждый раз, рН контролируют в начале каждого получаса, затем каждого часа, а в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель удаляют фильтрованием и трижды промьшают порци8

ями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 9,0), трижды порциями по 50 мл 1,0 М буфера ацетата натрия, содержащего по 1,0 моль хлористого

натрия каждьм (рН 9,0) и трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 9,0). В конце гель про- мьшают до полного удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,8 г иммо билизованной глюкоамилазы.

Активность: высвобождается .1,25 г глюкозы/Ч г ксерогеля.

Пример 12. 0,5 г Akrilex С-100 ксерогеля (связьшающая способ- - ность, т,е. СООН-содержание, 6,2 Мэкв/г, размер частиц 100 - 320 мкм) суспендируют в 50 мл 0,1 М

буфера фосфата калия (рН 7,5), после . чего добавляют 0,5 г N-циклогексил- -N -Г2-(4-морфо.линил)-этш13-карбо- диимид-метил-пара-толуол-сульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 2 мл раствора глюкоамилазы (125 мг/мл) и рН реакционной смеси устанавливают до 7,5. При

0-4 с время до завершения реакции составляет до 48 ч. Далее проводят обработ ку по предыдущему примеру. Получают 0,65 г препарата с активностью 1,3 г глюкозы/ч г.

Пример 13. Проводят иммобилизацию по примеру 12, используя 0,1 М к-фосфат (рН 7,5). По гучают 0,6 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: „в ьделяется 2,08 г глюкозы/ч«г ксерогеля.

Пример 14. 0,5г Akrilex С-100 ксерогеля (связьюающая активность, т.е. СООН-содержание, 6,2 1экв/г, размер частиц 100320 мкм); суспендируют в 50 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), после чего добавляют 1 г N-циклогексил-К - -Г2-(4-морфолинил)-этил карбодиимид- -метил-пара-толуолсульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 1,7 мл раствора глю- коамилазы (117,7 мг/мл) и рН реакци- онной смеси устанавливают 7,5. При : полное время реакции составляет до 48 ч, за этот промежуток суспензию перемешивают дважды по 6 ч каждый раз. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, затем каждый час, а в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель выделяют фильтрованием и трижды промьшают порциями по 50 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), трижды порциями по 50 мл 0,1 М буфера фосфата калия;)

120 мкм) суспендируют в 150 мл 0,1. М буфера фосфата калия (рН 7,5), после чего добавляют 1,2 г N-циклогексил-N - С2-(4-морфолинил)-этил -карбоди- имид-метил-пара-толуол-сульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после содержащего по 1 моль хлористого нат- ю чего добавляют 2,55 мл раствора глю- рия каждый (рН 7,5), и трижды порция- коамилазы (120 мг/мл) и рН реакцион- ми по 50 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5). Полученный гель в конце промывают от соли дистиллированной водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: выной смеси устанавливают 7,5. При 0- 4 С время завершения реакции составляет по 48 ч, причем во время этого

15 промежутка суспензию перемешивают дважды по 6 ч каждьй раз. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, позднее один раз в час, а в случае необходимости устанавливают

деляется 4,7 г глюкозы/ч т ксерогеля.

Пример 15. 05г Akrilex С-200-ксерогеля (связываюш;ая способность, т.е. СООН-содержание, 7,49 Мэкв/г, размер частиц 120 - 320 мкм) суспендируют в 100 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), после чего добавляют 1,25 г N-циклогексил- -N -f2-(4-морфолинил)этил -карбоди- имид-метип-пара-толуолсульфоната в : водяной бане со льдом при постоянном i перемешивании. Реакционную смесь пере- , мепшвают в течение 10 мин, после чего добавляют 2,6 мл раствора глюкоамилазы . (120 мг/мп) и рН реакционной смеси ; устанавливают 7,5. При 0-4 С время реакции до ее завершения составляет 48 ч, за этот промежуток времени сус- gg пензию перемешивают дважды по 6 ч каждьй раз. В начале реакции рН конт-, ролируют каждые полчаса, позднее каждьй час, а рН в случае необходимости доводят до нужного значения. После завершения реакции гель вьще- ляют фильтрованием и трижды промывают порциями по 100 мл О,1 К буфера фосфата калия (рН 7,5), трижды порциями по 100 мл 0,1 М буфера фосфата калия, содержащего по 1 моль хлористого натрия (рН 7,5), и трижды порциями по 100 мл 0,1 М буфера фос-. фата калия (7,5 рН). В конце полу15 промежутка суспензию перемешивают дважды по 6 ч каждьй раз. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, позднее один раз в час, а в случае необходимости устанавливают

20 до нужного значения. После завершения реакции гель выделяют фильтрова нием, трижды промьшают порциями по 150 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), трижды порциями по 150 мл

25 0,1 М буфера фосфата калия, содержа щего по 1 моль хлористого натрия (рН-7,5), и трижды порциями по 150 .0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5) В конце гель промывают до полного

30 удаления соли дистиллированной водо и лиофилизируют. Таким образом, пол чают 0,7 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 8,4 г глюкозы/чгг ксерогеля.

Пример 17. Способ осущест вляют по примеру 16, но используют 0,1 ч Akrilex С-100 ксерогеля.с содержанием СООН-групп 0,47 Мзкв/г и 0,2 г карбодиимида. Выход: 0,25 г

40 иммобилизованной глюкоамилазы с активностью 0,09 г.ч на 1 г ксерогеля П р и М е р, ы 18-22. Иммобилизацию проводят по примеру 17, но используют ксерогель с содержанием

45 СООН-групп 2,2 (пример 18); 3,8 .(пример 19), 4,6 (пример 20) , 5,0 (пример 21), 6,7 (пример 22) Мэкв/г Выход и, активность по примерам равны: 0,12 г и 2,1 г глюкозы/ч г

ченньй гель промывают до полного уда- 50 (пример 18), 0,13 г и 4,1 г глюколения соли дистиллированной водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: вьщеляется 765 г глюкозы/ч г ксерогеля.

Пример 16. 0,5 г Akrilex С-300 ксерогеля (связывающая способ- . ность, т.е,. СООН-содержание, 7,83 Мэкв/г, размер частиц 40 120 мкм) суспендируют в 150 мл 0,1. М буфера фосфата калия (рН 7,5), после чего добавляют 1,2 г N-циклогексил-N - С2-(4-морфолинил)-этил -карбоди- имид-метил-пара-толуол-сульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 2,55 мл раствора глю- коамилазы (120 мг/мл) и рН реакцион-

ной смеси устанавливают 7,5. При 0- 4 С время завершения реакции состав-N - С2-(4-морфолинил)-этил -карбоди- имид-метил-пара-толуол-сульфоната в водяной бане со льдом при постоянном перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 2,55 мл раствора глю- коамилазы (120 мг/мл) и рН реакцион-

ляет по 48 ч, причем во время этого

промежутка суспензию перемешивают дважды по 6 ч каждьй раз. В начале реакции рН контролируют каждые полчаса, позднее один раз в час, а в случае необходимости устанавливают

до нужного значения. После завершения реакции гель выделяют фильтрова- нием, трижды промьшают порциями по 150 мл 0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), трижды порциями по 150 мл

0,1 М буфера фосфата калия, содержащего по 1 моль хлористого натрия (рН-7,5), и трижды порциями по 150 мл .0,1 М буфера фосфата калия (рН 7,5), В конце гель промывают до полного

удаления соли дистиллированной водой и лиофилизируют. Таким образом, получают 0,7 г иммобилизованной глюкоамилазы. Активность: высвобождается 8,4 г глюкозы/чгг ксерогеля.

Пример 17. Способ осуществляют по примеру 16, но используют . 0,1 ч Akrilex С-100 ксерогеля.с со держанием СООН-групп 0,47 Мзкв/г и 0,2 г карбодиимида. Выход: 0,25 г

иммобилизованной глюкоамилазы с активностью 0,09 г.ч на 1 г ксерогеля. П р и М е р, ы 18-22. Иммобилизацию проводят по примеру 17, но используют ксерогель с содержанием

СООН-групп 2,2 (пример 18); 3,8 .(пример 19), 4,6 (пример 20) , 5,0 (пример 21), 6,7 (пример 22) Мэкв/г. Выход и, активность по примерам равны: 0,12 г и 2,1 г глюкозы/ч г

5

(пример 19)jO,19 и 7,7 г глюкозы/ч г (пример 20), 0,16 г, 9 г/ч-.г (пример 21) и 0,23 г и 20,2 г . глюкозы/ч-г носителя (пример 22).

Пример 23. Проводят иммобилизацию глюкоамилазы по примеру 10, но при рН 7,5, а также иммобилизацию глюкоамилазы в тех же условиях на биогеле СМ-100 (известным спосо11

бом). в обоих случаях связывается сходное количество глюкоамилазы по белку, но активность связанного фермента в процентах по предлагаемому и известному способам составляет 15,8 и 2,8%. Время полу нактивации (при 60 ) препарата по предлагаемому и известному способам равно соответ ственно 90 и 28 мин.

Таким образом, изобретение позволяет получать препараты иммобилизо- вднной глюкоамилазы с более высокой активностью и стабильностью.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем ее ковалентного связьшания с помощью водорастворимо- го карбодиимида с синтетическим но146137312

сителем на основе акриламида, о т - личаю. щийся . тем, что, с целью повьшения активности и стаg бильности целевого продукта, в качестве носителя использзпот пористые гранулы из сополимера акриламида, N,N -метипенбисакриламида и К-(амино- этил)акриламцда с содержанием групп 2,75 Мэкв/г или из сополимера акриламида; N,N -метиленбисакрил амида и акриловой кислоты с содержаки- ем СООН-групп 1,0 - 7,49 iэкв/г, размер пор которых не позволяет пром

15 никать в них веществам с мол.м.

20 ют неоднократно буфером с рН 4,5 - 9,0 и дистиллированной водой.

Составитель Н. Рыбальский Редактор И. Шулла Техред Л.Олийнык Корректор В. Гирняк

Заказ 548/59

Тираж 500ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 11303- 5, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Подписное