Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов или их частей Советский патент 1992 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к усовершенствованному способу иммобилизации микроорганизмов или их частей, используемых в процессах ферментации, в составе геля.

Известны многочисленные способы иммобилизации клеток микроорганизмов 1. Недостатки этих способов заключаются в сложности формирования частиц геля, а также невозможности разложения клеток в этих гелях.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов, включающий суспендирование клеток в растворе полисахарида и получение частиц re- ля путем внесения суспензии в растительное масло. Недостатком способа

является ингибирующее действие растительного масла на процессы размножения клеток и на их способность продуцировать различные соединения 2.

Целью изобретения является повышение продуцирующей способности клеток или их частей, а также увеличение роста клеток.

Способ заключается в суспендировании клеток микроорганизмов или их частей в водном растворе агара, введении суспензии в органический растворитель для образования частиц гелч с включенными клетками или их частицами, отделении и промывке частиц геля. В качестве органического растворителя используют растворители со следующими параметрами: растворимостью в воде 0,1-4,0 г на 100 г воды, вязкостью

0,455-7,0 сП при 20 С и температурой кипения 77,6-205,2°С. Введение суспензии в охлажденный до 0-10°С органический растворитель осуществляют по каплям при скорости оседания капель от 0,5 до 3,4 см/сек. ,

Способ позволяет значительно увеличить продуктивность иммобилизованных клеток (продуцирование антибиотиков клетками продолжается в течение 13 дней с трехкратной сменой культуральной среды), э также повысить эффективность роста клеток.

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

П р и м е р 1. Образуют суспензию спор, содержащую 5 х 10 спор/см3, с помощью стерильной дистиллированной воды из 7-8- дневной культуры на скошенном агаре Streptomyces tavencfulae ATCC 12950. Добавляют 10 мл3 полученной суспензии спор к 90 см водного раствора агара с концентрацией 4 мас.%, стерилизованного ранее при 121°С в течение 30 минут и затем охлажденного до 50°С. Полученную смесь вводят по каплям с помощью перистальтического насоса в 1000 холодного (5°С) изоокта- нола (2-этилгексанол). В этих операциях используются стерилизованные инструменты, Азот пропускают через изооктановую среду медленным потоком с целью предупреждения слипания гелевых шариков друг с другом. Введение азота продолжают в течение 4-5 минуг после завершения выкапывания, а затем геловые шарики отфильтровывают и промывают до удаления растворителя стерильной дистиллированной водой, содержащей 0,02 мас.% Tween 80. Гелевые шарики правильной сферической формы диаметром 1-5 мм получены в результате этого.

Подобные результаты получают, когда изооктанол по вышеприведенному процессу заменяют на этилацетат, циклогексэнол, н-амиловый спирт, бензиловый спирт, эти- лацетоацетат или н-бутилацетат. Параметры растворителей даны в таблице 1.

П р и м е р 2. Суспензию спор Streptomyces agrillaceum ATCC 12956, куль- тиоируемых на среде со скошенным агаром, содержащей 0,5 мас.% попо ч з сои, 1.0 мас.% глюкозы и 2,0 мас.% рото нистсго агара, применяют для инокуляции культуральной среды, простерилизованной для этого при 121°С в течение 20 минут и затем охлажденной до комнатной температуры, следующего состава, мас.%:

Мука из лесного ореха2,0

Гидролизованный казеин0,2

Глицерин4,0

Хлорид натрия0,3

Зх

Карбонат кальция0,5

(Величина рН культуральной среды, заполненной водопроводной водой, составляет до стерилизации 7,0).

Культуру встряхивают в течение 48

часов при 32°С на качалке со скоростью 360 об/мин, добавляют 10 см3 полученной вегетативной культуры к 90 см 4%-ного водного раствора агара с температурой 0 45°С, и гелевые шарики формируют из полученной смеси, как описано в примере 1. ПримерЗ.

Streptomyces diastatochomogenes, разновидность РО-31/М G 00366/спорулируют 5 на среде скошенного агара следующего состава, мас.%:

Дрожжевой экстракт0,1

Мясной экстракт0,1

Триптон0,2

0 Fe04

Глюкоза1.0

Na2HPCM0,713

КН2Р040,363

Промытый волок5 нистый агар2,0

(Величина рН культуральной среды, дополненной водопроводной водой, до стерилизации составляет 7,0).

Спорулированную примерно в течение 0 7-8 дней культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим раствором и регулируют концентрацию суспензии спор до 3 х 106 спор/см3. Полученную суспензию спор затем обраба 5 тывают так, как описано в примере 1, для получения шариков из агарового геля

П р и м е р 4. Клеточную суспензию, содержащую 8 х 10 клеток/см3 стерильной дистиллированной воды, готовят из 4-днев- 0 ной культуры со скошенным агаром Rhodococcus sp, NCAIM 8001003. Добавляют 10 см3 суспензии спор к 90 см3 стерильного теплового (45°С) водного раствора агара и формируют гелевые шарики из сме- 5 си так, как описано в примере 1.

Культуральную среду состава, мас.%; Холестерин21,0

Сахар0,5

0Соевая мука0,7

Сырой лецитин подсолнечника0,5 Tween и 600,2 КН2Р040,1

5СаСОз0,1

Nad0,1

MgS04-7H700.05

Struktol B 0200,1

стерилизуют при 121°С в течение 25 минут и затем охлаждают до комнатной температуры (величина рН культуральной среды до стерилизации составляет 6,0). Культурзль- ную среду инокулируют гелевыми шариками, полученными по вышеописанному, и затем встряхивают на плоском шейкере в течение 3 дней при 30°С со скоростью 300 об/мин. Уровень холестеролоксидазы в полученном бульоне определяют методом Allain и др.

П р и м е р 5. Штамм Streptomyces rubibaclens спорулируют на среде со скошенным агаром с составом, описанным в примере 1. Примерно 4-5-дневную спору- лированную культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим соляным раствором и регулируют концентрацию суспензии спор до примерно 5 х 106 спор/см3. Шарики из агарового геля формируют из полученной суспензии спор так, как описано в примере 1.

Культура л ьную среду состава, мас.%:

Дрожжевой экстракт 0,1

Мясной экстракт0,1

Триптон0,2

FeS04ЗхЮ 4

Глюкоза1,0

Агар2,0

стерилизуют при 121 °С в течение 25 минут и затем охлаждают до комнатной температуры. (Величина рН культуральной среды составляет 7,2 до стерилизации). Культу- ральную среду инокулируют гелевыми шариками, полученными согласно вышеописанному примеру и культуру встряхивают на плоском шейкере в течение 5-6 дней при 28°С со скоростью 280 об/мин. Полученный антибиотик детектируют известным методом тонкослойной хроматографии.

П р и м е р 6. Штамм Micromonospora inyoensis ATCC 27600 спорулируют на среде со скошенным агаром состава, приведенного в примере 3.

Примерно 7-8 дневную культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим соляным раствором и суспензия спор с концентрацией примерно 6 х 10б спор/см образована. Шарики из агарового геля формируют из этой суспензии спор так, как описано в примере 1.

Полученные гелевые шарики используют для инокуляции стерильной жидкой куль- туральной среды состава, данного Б примере 5, и культуру встряхивают на плоском шейкере в течение 5-6 дней при 28°С со скоростью 280 об/мин.

Полученный антибиотик может быть детектирован известным методом, с использо- ваиием Bacillus subtiiis в качестве измерительного микроорганизма.

П р и м е р 7. 10 см вегетативной культуры Streptomyces arglllaceus ATCC 12956, описанной в примере 2, добавляют к 90 см 4%-ного раствора агара и из половины этой

смеси получают частицы геля по способу в соответствии с примером 1. Вторую половину приготовленной смеси добавляют по каплям к стерильному подсолнечному маслу, охлажденному до 0-10°С. Частицы геля промывают, как это описано в примере 1, для удаления растворителя, соответственно масла (следует отметить, что растворитель при промывке удаляется полностью, тогда как мабло при аналогичной обработке остается на поверхности частиц в виде тонкой пленки). Культуральную среду, описанную в примере 2, засевают промытыми частицами и контролируют рост и продуцирующую способность клеток, иммобилизированных в геле, Полученные результаты приведены в табл.2.

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что в то время, как при использовании частиц геля, осажденных по способу в соответствии с настоящим изобретением иммобилизированные на них клети прекрасно размножаются и продуцируют антибиотики (интенсивное продуцирование антибиотиков позволяет трижды осуществ

лять смену культуральной среды), микроорганизмы, иммобилизированные на частицах геля, осажденных растительным маслом, размножаются медленно и слабо и вообще не продуцируют антибиотиков. Это однозьачно подтверждает ингибирующее действие растительного масла, используемого по известному способу.

Примерб. 10 см суспензии остатков клеток Mlcrococcus lysocieistus, продуцирующих полинуклеотид фосфорилазу, с удаленными стенками смешивали с 90 см 4%-ного раствора агара при температуре 50°С. Частицы геля получали из этой смеси таким же образом, как это описано в примере 1.

Способ позволяет повысить продуктивность клеток в процессе синтеза антибиотиков, а также увеличить рост клеток.

Формула изобретения Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов или их частей, включающий -/спендирование в водном

растворе полисахарида, введение суспензии в органическую среду для образования частиц голя с включенными клетками или их частями, отделение и промывку частиц геля, отличающийся тем, что, с целью повышения продуцирующей способности

клеток или их частей, а также увеличения роста клеток, в качестве полисахарида используют агар, а в качестве органической среды - органические растворители с растворимостью в воде 0,1-2,85 г/100 г воды,

вязкостью 0,455-7,0 сП при 20°С и температурой кипения 77.6-205,2°С, а суспензию вводят в органическую среду, охлажденную до 0-10°С, по каплям при скорости оседания капель 0,5-10,0 см/с.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: органический растворитель с растворимостью в водеО.1-2,85 г/100 г, вязкостью при 20°С 0,455-7,0 сП, температурой кипения 77,6-205,2°С используют в качестве жидкой гелеобразующей среды, которая не оказывает вредных воздействий на клешни микроорганизмов или их части. К суспензии спор Streptomyces savendulae АТСС 12950 добавзяют водный раствор агара, полученную смесь вводят по каплям в холодный органический растворитель с помощью насоса в присутствии азотз с целью предупреждения слипания гелевых шариков друг с другом. Гелевые шарики формируют из полученной смеси со скоростью осаждения капель 0,05-10 см/с. 2 табл.

Характеристики растворителей

х)

Логарифм константы распределения каждого растворителя, измеренной в смеси Н-октан:вода

Таблица 2 Свойства клеток, иммобилизованных известным и предложенным способами

Таблица 1