Способ получения иммобилизованной аминоацилазы Советский патент 1986 года по МПК C12N11/08 C12N9/64 

I

Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов конкретно к способу получения иммобилизованной аминоацилазыj применяемой для расщепления В1,-аминокислот.

Установлено, что на основе фермента аминоацилазы может быть получен иммобилизованный ферментный препарат с высокой активностью в результате присоединения фермента к носителю, полученному частичным гидролизом сополимера акриламида и N,N -метилен- -бис-акриламида типа Akrilex P l

Целью изобретения является повьше ние специфической активности фермен- тов.

Сущность способа заключается в том, что если этот сополимер подвернуть гидролизу кислотой (например, соляной кислотой или другой сильной кислотой) или щелочью (например, гидроокисью натрия), углекислым натрием или другим сильным основанием, то приблизительно 50%-CO-NH -групп преращается в карбоксильные группы, в то время как остальная часть-СО-Ш -групп в жестких условиях проведени реакции не распадается. Таким обра-- ;зом, в гидролизованном сополимере между карбоксильными группами вкли- ниваются неизменные-СО-МНо-группы, которые подл.ерживают карбоксильные 1 руппы в благоприятном пространственом положении.

Когда фермент аминоацилазы присоединяют к образовавшимся карбоксильным группам в результате известного активирования карбодимидом, фиксированные молекулы фермента вследсвие благоприятного пространственног расположения карбоксильных групп не препятствуют друг другу выполнять свою функцию.Б результате этого препарат фермента отличается очень выской специфичной активностью.

Предлаг аемый способ осуществляется следующим образом. Частично гидроли- зованный сополимер, образовавшийся в результате кислотного или щелочного гидролиза сополимера акриламида и К,ы -метилен-бис-акриламида типа . Akrilex Р, обрабатывают растворимым Е воде или растворимым при температуре ниже О С в органическом растворителе карбодиимидным соединением и на акти- Еированньш указанным способом носитель наносят аминоцилазу в растворе со значением рН 6, 5-8,0. Полученный продукт

5

0 5 0

5

0

5

0

5

промывают,после чего в нужном случае сушат.

При осуществлении способа в- качестве фермента может быть применена выделенная любым известным способом аминоацйлаза любого происхождения, однако наиболее предпочтительно применять в качестве исходного вещества фермент, выделенный из почек млекопитающих .

Для активирования частично гидро- лизованного сополимера типа Akrilex Р в качестве карбодиимидного соединения могут быть применены, например, 1-циклогексил-3-(2-морфоли- ноатш -карбодиимид-мето-п-толуол- сульфонат или 1-этил-3-(3 -диметил- аминопропил)-карбодиимид. В качестве карбодиш-шдного-соединения наиболее предпочтительно применять растворимые в воде вещества. Среди карбоди- имидных соединений, растворимых только в органических растворителях, при осуществлении способа могут быть применены лишь такие производные, которые в применяемом растворителе имеют соответствующую растворимость при низкой температуре (т.е. ниже ).

, На активированный носитель амино- ацилазу наносят из раствора со значением рК 6,5 - .8,0, причем наиболее предпочтительно, когда рН гэтого раствора составляет около 7,G. Наиболее целесообразно растворять аминоацилазу в 0,1 М буферном растворе фосфата калия (рН 7,0).

Образовавшийся в результате реакции связывания препарат фиксированного фермента промывают известным способом, после чего в нужном случае сушат. Однако содержащий фермент препарат может быть приготовлен в присутствии соответствующих стабилизаторов, например азида натрия в виде суспензии.

Специфичная активность полученного по изобретению препарата, содержащего фиксированный фермент, соста в- ляет 150-200 ед.мг ксерогеля, что в сравнении с активностью 0,55 - 2,24 ед.мг ксерогеля, достигаемой при осуществлении известного способа, означает повышение активности по крайней мере на два порядка.

При исследовании препаратов нового типа, содержащих иммобилизованный фермент, пришли к выводу, что в результате иммобилизации возрастает

3

стабильность фермента при значениях рН, лежащих в основной области, что особенно благоприятно в случаях, когда препарат иммобилизованного фермента применяют для расщепления DL- аминокислот.

Пример 1.30г ксерогеля Akrilex суспендируют в 1 л 1 и. водного рас-твора гидроокиси натрия. Суспензию выдерживают 3ч при 50 С. Набухший гель промывают до нейтральной реакции 12 л дистиллированной воды, после чего промывку продолжают 10,5л 0,05 н. соляной кислотой. Наконец, гель промывают 30 л дистиллированной воды. Промытый гель подвергают лиофилизации.

Получают 26 г .носителя фермента, связывающаяся емкость которого составляет 6,14 М-ЭКВ. г.

Пример2. Юг ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 500 мл буферного раствора фосфата калия (рН7,0) Затем к приготовленной суспензии на водяной бане, охлаждаемой льдом, прибавляют гфи энергичном перемешивании полученный с 250 мл холодного ) буферного раствора раствор 20 г 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)- . -карбодиимид-мето-п-толуолсульфона- та. После 10 мин перемешивания к реакционной смеси прибавляют полученный с 250 мл холодного () буферного раствора раствор 5 г аминоаци- лазы. Суспензию перемешивают 48 ч при + 4°С, затем гель отделяют и промывают 3 раза 1 л О,1М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), 3 раза 1 л 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0), содержащего 0,5 моль хлористого натрия, и, наконец, 3 раза 1 л 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0). Затем гель 4 раза промывают 2,5 л дистиллированной воды с целью удаления соли и проводят лиофилизацию.

Выход: 18 г фиксированной амино- ацилазы. Активность:гидролиз

158 мкмоль N-aцeтил-L-мeтиoнинa (ч/мг) 50 сухого вещества.

Пример 3. Юг ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1 , суспендируют в 500 мл О,1 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0). Затем на охлаждаемой льдом водяной бане и при энергич

5

0 15

20

5 о

5

0

5

0

5

7884

ном перемешивании к суспе 1зии прибавляют полученный с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор 10 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)- -карбодиимида. После И) мин перемешивания к реакционной смеси прибавляют полученньп с 250 мл холодного ( + 4 С) буферного раствора раствор 5 г амино- ацилазы. Суспензию перемешивают 48 ч при +4 с, гель отделяют и промывают 3 раза 1 л О,1 М буферного раствора фосфата калия, 3 раза 3 л 0,1 М буферного раствора фосфата калия, содержащего 0,3 моль хлористого натрия, 3 раза 1 л О,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,0) и, наконец, 4 раза 2,5 л дистиллированной воды. Отмытый от солей гель подвергают лиофилизации.

Выход: 16 г фиксированной амино- ацилазы. Активность: гидро.гшз 202 мкмоль Ы-ацетил-Ь-метионина(ч/мг) сухого вещества.

Пример 4. 0,5 г ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1 ,.суспендируют в 25 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 6,0) и затем добавляют к полученной суспензии при охлаждении на ледяной водяной бане и постоянном перемеишва- нии холодный (+4 С) раствор 1 г 1- -циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-кар- бодиимид-мето-п-толуолсульфоната в 12-,5 мл буферного раствора. После 10 мин перемешивания к реакционной смеси добавляют раствор 0,25 г амино- ацилазы в 12,5 мл холодного (+4 с) буферного раствора. Суспензию перемешивают 48 ч при +4 С, гель отделяют и промывают его последовательно трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 6,0), трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 6,0), содержащего 0,5 М хлористого натрия, трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 6,0) и четырежды 125 мл дист1 л- лированной воды. Отмытый от соли гель лоифилизируют,

Выход: 0,68 г иммобилизированной аминоацилазы. Активность: гидролизу 21,4 мкмоль Ы-ацетил-Ь-метионина (ч/мг) сухого вещества.

Пример 5. 0,5 г ксерогеля, полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 25 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 8,0) и добавляют к суспензии при охлаждении на ледяной водяной бане.

5 1/1287886

при постоянном перемешивании растворфата калия (рИ 8,0), 3 раза 50 MJT

1 г 1-циклогексил-3-(2-морфолино-0,1 М буферного раствора фосфата

этил)-карбодиимид-мето -п-толуол-суль-калия (рН 8,0), содержащег-о 0,5 М

фоната в .12,5 мл холодного (+4 С)хлористого натрия, 3 раза 50 мл О, 1 М

буферного раствора. После 10 мин буферного раствора фосфата калия

;ремешивания к реакционной смеси до-(рН 8,0) и 4 раза 125 мл дистиллиробавляют раствор 0,25 г аминоацилазыванной воды. Отмытый от соли гель

в 12,5 мл холодного () буферноголиофилизируют. .

раствора. Суспензию перемешиваютВыход: 0,78 г иммобилизированной

48 ч при , гель отделяют и про- О аминоацилазы. Активность: гидролиз

мывагот его последовательно 3 раза52,9 мкмоль N-aцeтил-L-мeтиoнинa

50 мл 0,1 М буферного раствора фос-(ч/мг) сухого вещества.