Способ определения поверхностного давления биологических мембран Советский патент 1989 года по МПК G01N33/483 

1

Изобретение относится к молекуляр- ной биологии и может быть использовано для изучения поверхностного давления различных клеточных мембран и .- регистрации изменений, происходящих в последних.

Цель изобретения - повышение точности способа и обеспечение возможности определения поверхностного давления различных биологических мем-- бран.

Определяют поверхностное давление биологических мембран, при котором

м

;меряют любым известным биологическую активнос ностное давление биоло бран определяют по фор П. А

/ t (A./A4) при (A,/AI) i ехр(-); - / 1;

HI при A,/Aj exp (n/flj);

П,

П.

Л

Ai/A4) при А,/А,ехр( -),

(Л С

происходит разрушение монослоев поверхностно-активных веществ (ПАВ), и площади, занимаемой одной их молекулой на границе раздела полярной и неполярной фаз. Из них выбирают два .

:поверхностно-активных вещества с оди- наковой площадью молекул, но с различным поверхностным давлением. При этом первое вещество должно обладать большим поверхностным давлением. Из;меряют любым известным способом их биологическую активность и поверхностное давление биологических мембран определяют по формуле П. А

/ t (A,/AI) i ехр(-); - / 1;

4ai 05

сд а

О) 00

t -

П,

П.

-где А. А„ П. 10

П. 15

биологическая активность : первого поверхностно-активного вещества; биологическая активность второго поверхностно-активного вещества; поверхностное давление, при котором разрушается монослой первого поверхностно- активного вещества, сформированный на границе раздела полярной и неполярной

фаз;

поверхностное давление, при котором разрушается монослой второго поверхностно- активного вещества, сформит р ованный на границе раздела полярной и неполярной фаз; поверхностное давление биологической мембраны. Использование двух поверхностно- активных веществ с одинаковой площадью на границе вода-мембрана, т.е. эти поверхностно-активные вещества обладают родственным химическим строением, а следовательно, аналогичным молекулярным механизмом действия-на биологические.мембраны, позволяет применять эти соединения для определения поверхностного давления различных биомембран (клеток эукариотов, прокариотов, оболочек н ирусов и т.д.)

20

П

IW

а не только мембран эритроцитов

(лрототип).

В качестве поверхностно-активных

веществ используют различные мембра- но-активные соединения, обладающие одинаковой площадью на границе раздела фаз непосредственно действующих на агентов, но с различным поверхностным давлением, при котором разрущаются их монослои на границе раздела полярной и неполярной фаз. Такими поверхностно-активными веществами могут быть мыла и детергенты, антибиотики, компоненты различных ядов (например пчелы, кобры и Др.) и прочие соединения, удовлетворяющие указанным требованиям. Способ осуществляется следующим

образом.

Определяют поверхностные давления, при которых происходит разрущение монослоев поверхностно-активных веществ, и площади, занимаемые их молекулами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Определение укаЙ65768

1занных параметров производят известными способами, например, по-сжатию монослоев поверхностно-активных веществ, нанесенных на границу раздела фаз вода-воздух, с использованием метода Вильгельма; Затем выбирают два поверхностно-активных вещества с одинаковой площадью молекул, но с разным поверхностным давлением. При этом первое вещество должно обладать большим поверхностным да1шением. Далее определяют биологическую активность выбранных соединений, которую можно определить по изменению одного из множества параметров, описывавших функционирование биологических мембран, с помощью различных известных способов.

Так, биологическую активность выбранных поверхностно-активных веществ можно определять по лизису клеток, который измеряется различными известными способами, например, как в 25 прототипе, по регистрации (спектро- фотометрически) скорости, выхода гемоглобина из эритроцитов при нарушении целостности их мембран. Биологическую активность поверхностно-активных веществ М05КНО также определять по скорости или степени изменения активности мембранных ферментов, которые регистрируются различными известными способами, например, по набуханию митохотщрий или по скорости поглощения ими и.пи по определению отношения концентраций поверхностно-активных веществ, вызывавших одинаковый биологический эффект, например, путем определения концентраций поверхностно-активных веществ, необходимых для подавления роста микроорганизмов.

Расчет величины поверхностного давления биологических мембран (nj осуществляется с использованием величин поверхностного давления, при котором происходит разрушение монослоев (П, и П,), и отношения биологических активностей (А и А) поверхностно-активных веществ при их действии на мембраны по приведенным

формулам.

Примеров качестве поверхностно-активных веществ используют грамицидин S и его потностью L аналог, которые при воздействии на мембраны образуют комплексы с их фосфолипидами. Эти комплексы на

35

40

45

50

55

55

верхности раздела фаз воздух-0,001 М .раствор КС1 образуют монослои, которые разрушаются при поверхностном давлении 34,5 дин/см для грамицидина S и 9,0 дин/см для его аналога. Площади комплексов для грамицидина S и полностью L грамицидина S равны, соответственно, 145 А и 145-150 А, т.е. эти комплексы имеют одинаковую площадь на границе раздела полярной и неполярной фаз (поверхностное давление регистрируют по методу Вильгельма). В опытах для определения поверхностного давления биологических мембран берут в двух пробирках суспензию митохондрий печени крыс с одинаковой концентрацией (например 0,5 мг белка/мл), рН 7,3-7,4. В одну пробирку добавляют метональный раствор грамицидина S, а в другую - ме- танольный раствор полностью L грамицидина S в количествах, необходимых для того, чтобы получить одинаковую концентрацию этих соединений (например 20 нМ на мг белка митохондрий) . Затем через определенное время (например, через 1 мин после перемешивания) определяют скорость дыхания митохондрий по поглощению кислорода в амперометрической ячейке типа Кларка. Установлено, что скорость дыхания в первой пробирке в 10 раз больше. Отношение биологических активностей (А ,/А j) равно 10, а ехр (П,/П) - ехр(34,5/9,0)45. Следовательно, выполняется условие, указанное в первом варианте. Тогда поверхностное давление мембран митохондрий

,г.1п А,,0 ,0 дин/см

Пример 2. В качестве поверхностно-активных соединений используют те же вещества, что и в примере 1 В опытах для определения поверхностного давления биологических мембран берут в двух пробирках суспензию эритроцитов человека с одинаковой концентрацией (например, 10 клеток/мл) . В одну пробирку добавляют метанольный раствор грамицидина S, в другую - метанольный раствор полностью L грамицидина S в количествах, чтобы получить одинаковую конечную концентрацию этих соединений, например 0,1 кМ. Затем регистрируют скорость лизиса эритроцитов по способу, указанному в прототипе.

новлено, что скорость лизиса эритроцитов в первой пробирке в 45 раз больше. Отношение биологических активностей (,) равно 45, а ехр (П.П;,) ехр (34,5/9,0) 45. Следовательно, выполняется условие, указанное во втором варианте. Тогда поверхностное давление мембран эритроцитов человека

Плл

и, дин/см.

ПримерЗ. В качестве поверхностно-активных веществ используют те же соединения, что и в примере 1. В опытах используют Staphylococcus aureus в среде, которая на 1 л содержит 10 г глюкозы, 5 г NaCl, 5 г пептона, 30 мл бульона Хоттингера, рН 7,0-7,2, и определяют антимикробную активность поверхностно-активных веществ способом серийных разведений. Грамицидин подавляет рост микроорганизмов при конечной концентрации Гъ/мл, а его аналог - 60-70 /мп. Отношение биологических активностей (А,/А) равно 60-70, а ехр (П,/П) ехр (34,5/9,0) 45. Следовательно, выполняется условие, указанное в третьем варианте. Тогда поверхностное давление мембран П,П2А

, (Ц « Использование предлагаемого способа позволяет более точно, по сравнению с прототипом, определить поверхностное давление различных биологических мембран с помощью двух, заранее отобранных поверхностно-активных веществ. По прототипу поверхностное давление мембран эритроцитов человека лежит в диапазоне 31-35 дин/см, д определенное по предлагаемому 34,5J ±0,3 дин/см.

J.

Формула изобретения

Способ определения поверхностного давления биологических мембран путем обработки биологических мембран поверхностно-активными веществами, о т- л и чающийся тем, что, с целью повышения точности способа и обеспечения возможности определения поверхностного давления 15азличных биологических мембран, определяют поверхностные давления, при которых происходит разрушение монослоев по1465768

верхностно-активных веществ, и площади, занимаемые одной их молекулой на границе раздела полярной и неполярной фаз, из них выбирают два поверхностно-активных вещества с одинаковой площадью молекул, но с раз8

8

ным поверхностным давлением, при этом перйое вещество обладает большим давлением, измеряют их биологическую активность,а поверхностное давление П биологических мембран определяют по формуле

Изобретение относится к области молекулйрной биологии и может быть использовано для изучения поверхностного давления (Пд,) различных клеточных мембран и регистрации изменений в них. Цель - повышение точности спо-- соба. Определяют Пд, при которых происходит разрушение монослоев поверхностно-активных веществ (ПАВ), и площади, занимаемые их молекулами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Выбирают два ПАВ с одинаковой площадью молекул, но с разным П,., при этом первое вещество обладает большим Ид,, и определяют биологическую активность выбранных соединений. Расчет величины П„ проводят по формуле с использованием величин П, при которых происходит разрушение монослоев (П и П), и отношения биологи- ческ}1х активностей ПАВ (А, и А) при их действии на мембраны. а $

(А./А,,) при А. (П,/П,); ц 1;

П, при Af/Aj ехр ();

П,П

--- In (A,/A,j) при A/A, (.),

Ilj и П - поверхностное давление, при котором разрушается монослой соответственно второго и первого веществ, сформированный на границе раздела по

лярной и неполярной фаз;

Ai и АЛ биологическая активность соответственно первого и второго веществ .