Штамм бактерий РSеUDомоNаS FLUoReSceNS, синтезирующий внеклеточный эмульгатор Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12N1/20 C12R1/39 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, способного утилизировать углеводороды (н-алканы) с образованием поверхностно-активного вещества - эмульгатора, который может быть использован для повьш1ения нефтеотдачи высоковязких нефтей со снижением вязкости и облегчения.их транспортировки по трубопроводам, очистки окружающей среды.

Дель изобретения - новый штамм бактерий синтезирующего на минеральной среде с н-алканами внеклеточный эмульгатор, нерастворимьй в воде и ,не требующий для его выделения из культуральной жидкости дополнительных стадий обработки.

Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВК ПМ В-4097 (GS ALK) выделен из активных илов сточных вод предприятий микробиологической про- мьшшенности с помощью длительной экспериментальной адаптации к н-алканам как единственным источникам углерода и энергии.

Выделенньй штамм проверен на активность при хранении и пересевах на неселективные среды.

Штамм PS. fluorescens GS-ALK имеет следующую характеристику.Культурально-морфологическиепризнаки.

Среда для хранения - мясо-пептон- ный агар (МПА). На твердой среде МПА штамм образует золотисто-желтые

4

- Ю

NJ

QD Од

колонии, а на жидкой пленочно- слизистый рост Клетки слегка изогнутые палочки, подвижные (движутся при помощи полярных жгутиков грамотрицательные, спор и капсул не образуют. На среде КИНГА и КИНГБ флюоресцирующий пигмент не продуцируется. Длина клеток на МПА и МПА с 7% глицерина 1,2-2,А мкм, ширина 0,8-0,9 мкм, на среде с н-алканами (тетрадекан и гексадекан) клетки имют длину И 1,0-2,0 мкм, ширину 1,0- 1,2 мкм. На твердой среде (МПА) образует слизистые, размером 1,3 мм, золотисто-желтые полупрозрачные колонии.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб, растет при 4°С. Оптимальная температура роста 28°С, рИ 6,8- 7,0. Крахмал не гидролизует. При росте на средах, содержащих.органическую серу, выделяет сероётэдород. Обладает каталазной, оксидазной, липазной и уреазной активностью. Усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, арабинозу, лактозу и ксилозу .с образованием кислоты-. Утилизует , аргинин, нафталин, дифе нил, алифатические углеводороды с

содержанием атомов углерода от С до .

Штамм не патогенено

Синтез эмульгатора штаммом GS-ALK происходит на средах простых синтетических, не содержащих каких-либо индукторов. Предпочтительным источ- Н1жом азота являются соли аммония.

Кратковременное хранение штамма осуществляется на косяках с МПА при 4 С. По истечении 2-3 мес желателен пересев на свежие среды МПА. Для более длительного хранения штамм помещают либо в кельвинатор при -70°С в 10%-ном растворе глицерина, либо хранят в лиофилизованном состоянии в запаянных ампулах с 12%-ной сахарозой в качестве криопротектора.

Штамм Pseudomonas fluorescens GS-ALK способен через 40-48 ч культивирования синтезировать эмульгатор в количестве 15 г/л, из расчета на сухой вес 1,4 г/л. Гексадекан, ис пользуемый в качестве единственного источника углерода и энергии, потребляется за это время на 95-98%.

Эмульгатор в культуральной жидкости находится в эмульсионном слое в виде кремообразной массы, легко

0

5

застьшающей при температуре ниже +10 О, и отделяемый центрифугированием при (4500 об/мин, 25 мин). Эмульгатор представляет собой сложную смесь нейтральных липидов и гли- колипидов. Сложный состав эмульгатора во многом определяет стабильность получаемых эмульсий. Эффект эмульгирования проверен на ряде нефтей. Эмульгатор в концентрации не более 0,05% способствует образованию стойких эмульсий нефти с водой.

;, Свойства штамма синтезировать эмульгатор иллюстрируются примером.

Пример. Штамм Ps. fluorescens GS-ALK выращивают в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода гексадекан. Состав среды, г/л воды: К2НР04 4,3; KHiP04 3,4j (NH4)-2SO 2,0; Mg804 0,2; CaCl.a 0,026; MnCl 2.0,001; FeS04 0,0006; WaMoO 0,002; гексадекан 1%, pH 7,0. Стерилизация 5 при 0,5 атм 30 мин. Инокулируют среду культурой, выращенной в течение 24 ч в среде, описанной вьшге. Поел двух суток культивирования при в колбах на 250 мл на качалке, дающей 220 -об/мин, отделяют синтезированный эмульгатор.

Эмульгатор в культуральной жидкости находится в эмульсионном слое в виде кремообразной массы сложного состава, которая легко отделяется от культуральной жидкости центрифугированием (4 500 об/мин) при 0° с в течение 25 мин.

0

0

5

0

5

0

Выход влажного эмульгатора 15 г/л, из расчета на сухой вес 1,4 г/л.

Определение эмульгирзгющей активности эмульгатора.

Активность эмульгатора образовывать эмульсию определяют следующим образом. 5 мл 0,1 М добавляют 5 мл смеси н-алканов (Ci4 2,6; Сд 74,7; 19,5; С,;,2,6; С 0,6 (%), вносят аликвоту (0,1 мл), эмульгатора и интенсивно перемешившот с помощью миксера в течение 30 с. Ак- тивность эмульгатора определяют периодическим измерением высоты столба образовавшейся эмульсии (см), которая составляет через 5 мин 7 см, 20 мин 6 см.

Таким образом, данный штамм Р. fluorescens GS-ALK при росте на

514724966

гексадекане может быть использован Формула изобретения для синтеза поверхностно-активного Штамм бактерий Pseudomonas fluo- вещества, обладающего эмульгирую- rescens ВКПМ В-4097, синтезирующий щей активностью.внеклеточный эмульгатор.

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий PSEUDOMONAS FLUORESCENS В-4097 /GS-ALK/, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ ЭМУЛЬГАТОР, КОТОРЫЙ МОЖЕТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАН ДЛЯ НЕФТЕОТДАЧИ, ОЧИСТКИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ЕМКОСТЕЙ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ, И ДРУГИХ ЦЕЛЕЙ. ЦЕЛЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЯВЛЯЕТСЯ ПОЛУЧЕНИЕ НОВОГО ШТАММА БАКТЕРИЙ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НА МИНЕРАЛЬНОЙ СРЕДЕ С ГЕКСАДЕКАНОМ ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ ЭМУЛЬГАТОР, НЕРАСТВОРИМЫЙ В ВОДЕ И НЕ ТРЕБУЮЩИЙ ДЛЯ ЕГО ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ СТАДИЙ ОБРАБОТКИ. ШТАММ КУЛЬТИВИРУЮТ НА МИНЕРАЛЬНОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕКСАДЕКАН В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА И ЭНЕРГИИ. ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 24-48 Ч. ВЫХОД ВЛАЖНОГО ЭМУЛЬГАТОРА 15 Г/Л, СУХОГО 1,4 Г/Л. ЭМУЛЬГИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ПО ВЫСОТЕ ОБРАЗОВАВШЕЙСЯ ЭМУЛЬСИИ, КОТОРАЯ СОСТАВЛЯЕТ ЧЕРЕЗ 20 МИН 5 СМ.