Способ проведения микрохирургических операций на изолированных яйцеклетках Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

1

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и сельскому хозяйст- ву и может быть использовано при проведении микроопераций на клетках.

Целью изобретения является повышение автоматизации способа.

На фиг. 1 показан питатель; на фиг, 2 - кривая импульса напряжения,.

Способ осуществляется следующим образом.

Заполняют питатель I (фиг. I), выполненный в виде конической микропипетки, суспензией клеток 2 в элек 2

тролнте (например, в физ иол о ском растворе, содержащем ионы растворенных в воде компонентов), далее з полняют электролитом накопитель 3, выполненаьй -также в виде конической мнкропипетки. Помещают кончики питателя 1, накопителя 3 и микроприсоса 4 в тот же злектролит таким образом, чтобы область I всасывания микроприсоса 4 и область II всасывания накопителя 3 перекрывались. Через измерительное сопротивление 5 прикг1адыва- куг к злектроду 6 питателя 1 и элек4

СО ОЭ СП

ю

3147

троду 7 постоянное электрическое напряжение и одновременно,через питатель I создают гидравлический проток, вытеснянйций из питателя клетки в область I всасьшания микроприсоса 4, При этом при прохождении единич- ной клетки 2 через, выходное микроот- верстие питателя I увеличивается сопротивление между электродами 6 и 7, ток уменьшается и с сопротизапения 5 снимается импульс напряжения . (фиг. 2), амплитуда которого пропорциональна объему клетки 2. После окончания импульса останавливают гид- равлический проток и сниманп электрическое напряжение через питатель, обеспечивая иыход из него только од ной клетки 2 (положение а клетки 2, фиг. 1). -

Амплитуду импульса иf, питателя } при условии, что объемная доля Р клеток намного меныие 1, т.е. р «с 1 и удельное сопротивление р мембр - ны клеток намного больше удельного сопротивления р электролита, т.е. РЦ РЭА определяют по формуле

16lonP,«V,,

М1;„, (

(1)

пит

где 1д„ - ток питателя при отсутствии ;в его выходном отверстии

клеток;.

РЭЛ удельное сопротивление элек- тролита;

V, объем клетки 2 до проведения йад ней микрооперадии$ f - фактор формы и ориентации

клеток; Л„„ - диаьйтр выходного отверстия

ППГ

питателя J.

,- отношение сопротивления пи- тателя к эвивалентног у сопротивлению нагрузки. Далее создают через неподвижный микроприсос 4 гидранпичесйий проток, присасывающий клетку 2 к его кончику (положение б кпетки 2) и произ водят воздействие над ней никройн- струментом.в. После выполнения мани пуляций микроийструментом 8 создают через микроприсос 4 обратный гидрав- - лический проток, освобождая клетку и помещая ее в область II всасывания накопителя 3 (положение клетки 2). Через измерительное со- ; противление 9 прикладывают к электроду Ш накопителя 3 и электроду 7 постоянное электряческье напряжение я

Q 5 0

5

0

5

0

5 д 5

создают через накопитель 3 гидравлический проток, всасывающий через его- входное отверстие внутрь клетку 2, Снимают при этоМ . С сопротивления 9 импульс напряжения амплитуда которого рйвна

Т7 - i§Ja«Jl9iY2Kftf /5х

MV. f i-A f j+ )

нак :нак/

где I „ - ток накопителя 3 при отсут- OH.

ствии в его входном отвер .стии клетки 2;

V- - объем кпетки 2 после прове- v.n.

дейия над ней гдакрооперациИд

нак диаметр входного отверстия

накопителя5

иак отношение сопротивления накопителя к эквивалентному

сопротиапению нагрузки.

.1. , ,

После oKoi-гчания импульса (положение г клетки 2) останавливают ,гидравличес1сий проток через накопитель 3 и снимают электрическое на- щ яжвние. Далее повторением всех манипуляций Производят .проведение рохирургических операций над всеми клетками 2 пита;теля I,

И р и м е РО Требуется провести автоматическую операцию внутриклеточ ной микроиньекции в клетки диаметром

мкм, объемом 2,2-10 мкм (2,2 10 см)в помещенных в физр аст- воре с удельным сопротивлением 70 Ом см щзи . Ток питателя и накопителя 1, 1он 100 , диаметр выходного питателя dn, 120 мкм, диаметр входного отверстия .накопителя мкм, фактор .l и ориентации для сферических клеток ,5, отношение сопротивления питателя к эквивалентног 1у сопротивлению нагрузки п„ 0,9 и для на1сопителя 0,9э расход раствора при прокачке через питатель и накопитель MK /CS расход ра створа при всасывании и нагнетании через микроприсос Qn 2,,5-10 мк /с, объем инъецируемой, дозы Vn 10 мкм (). Время закрепления клетки на микроприсосё с. Время всасывания зшетки в накопитель t : с. По формуле (I) определяют амплитуду нг-шульса U,, снимаемого с измерительно,го сопротивления пит а- г еля при прохрждекии через его ное отверстие клеткиs

и.

я l IsnJl &YLyl,

d,, (1+ гт,и.

ли

(WT il

16 100 70

з7Т4() (

Os0095.B -95 ма

Определяют объем области I Bcacbisa- никроприсосом при захрезшекнк ;отетки

V, inp tnp 2,5-10 мкм /с-0,5 с. 2,25- Ш iW.

Для упрошйння расчетов приннмаки- областн I всась вания микрокрн- coca сфсфи -чбсг.ой;, имеющей . В который равен

л -г а следовательно, кон-чики шстатепл и 1 кроприсоса устанавпквш-тг об- разоМ;, -п обы они торгдаш- касались Боображаекой поверхности сферы даг аметрог D 13A мкме

Прикладывают к питателю постсян ное/злектрическос; напряжение таким образомр чтобы ток питателя бьш равен 100 мкА к создают через nsn-a- тель гидравлический проток сускензш- клеток с расходом МО мкм /с. После снятия импульса с кого сопротивления питателя а равного 95 кВ, останавливают гидравлический прсток через время tj,, обеспечивающее выдавливание из питателя объема электролита (физраствора) вместе с клеткой меньшего юти равно- то. V,. Время t между окончанием :импульса и окончанием гидpaa ичecкo- го протока через питатель пси этом определя1эт т ;з у еловая

Vi3 j25-10 мкм ,, -с

. „д„. о 2..„-.-i,...- «u,-i;j

йт-.Q 5 iO жм /c

-Создают через неподвижный микро- присос вса а ша5эщий проток и присасы веют к его кончику клетку Далее вводят Б кгтатку гдакропипетку с инь- ецируеьым растзоромв вьп есняют из нее требуемую дозу мк s ° ° еяе чего выводят микропипетку из 1шетхи. Созда.ют через микроприсос ягдравлический проток в другом на- гравпении, откреплякщий клетку, и вводят ее з об.часть II всасывания

накопителя. При этом объем обпастг

, .

II всасывания изкопитепь определ зягг из условия

.4ar5 Q .кк /с-0,5 с- 2,5 10 жм

Принимают адрму облзстт. всасываяля накопителя сфери-ческой, имеющей ди™

Ш

аметр Drj-s коч орый равен

3|6vu .,.Q „,.

. -i:u- -

УстанаБлквйют коютк накопителя таким образом„ чтобы его тореп касапся

IS : нооЗр,ажаеждй поверхности, сфеоы ди- йметром S5j.169 ькм,, перекрывающий область I всйггьгвани.ч микроприсоса. Определяют иг-отульс нагфйжения ицс,,; , скимаенохх) с измерительного сопро -0 TKsneimH накопитапя при прохождении через аго входное отверстие клетки:

n t ib i - LK C I- W

х-де

V (V +Vn 2кл 3

как

клетки по- спе введения в нее. инъецируеь.го раствора.

16- 100 /0(2.2 10 | +10 °)- .bL. 37ТА Т20 ТО) (+0 5 9)

мВ.

35

Прикладывают к накопителю постоянное электрическое напряжение таким: ofipasoMj чтобы ток I от накош-;теля был равен 100 зкA и создают через накопитель всасыраюти й . П5дравличес кий проток. Поспе.окончания импульса 40 к прохождении клетки

внутрь накопителя останавливают гид- равпический проток и снимают электрическое напряжение. Повторением всех -манипуляций проводят и)-гьец1фование

45

всех клеток питателя.

Применение предасженного- способа позволяет обеспечить автоматизацию i-икрохирургкческих операцш над иэо лированныЕж клетк.ам. и их

травмирование,,. ьо

о .р мул

3 о б р е т е н и я

Способ проведения микрохирургических операций на изолированных яйцеклетках, включаюи З й закрепление кп.етки на Jикpoпpиcoce с последующим прове.дением операилда, о т л и ч а- ю п к и с я тем что, с целью павы фог.2

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и сельскому хозяйству и может, быть использовано при щ)Оведении микрохирургических операций на изолированных клетках. Целью изобретения является повьшение ав томатизации способа. Способ позволяет полностью автоматизировать основные микрооперации с изолированными клетками, такие как внутриклеточная микроинъекдия, разрезание яйцеклетки к др. , и сшгзить травмирование -клеток путем поочередного закрепления клеток 2 на неподвижном микро- присосе 4. Контроль выхода одиночной клетки 2 р область всасываття -1икро- присоса из питателя 1 и контроль всасывания клетки.2 в накопитель 3 при отводе ее из зоны операции после воздействия на нее микроинструментом 8 и открепления от микроприсоса 4 осуществляют кондуктометрическим методом, не требувлдим освещения клетки, фиксируя.импульс напряжения при прохождении клетки через микроотверстия питателя I и накопителя 3, а угсрав- .ление микроинструментом 8 проводят относительно строго заданного положения закрепленной на неподвижном микроприсосе клетки 2. 2 ял. й