Изобретение относится к химии гетероциклических соединений в частности к способу получения новых производных резоруфина общей формулы la .( или 16 ,
(сн2)тс(о)цъ2
О
/
ра или ксантина, причем радикал -(СНг)т-С-Ь1-1 -А при
находится в положении 4 и при га«2 в положении 2, а в случае и ,8-6,4
Лг-Ґсн2о ш/ |
сн3 оо
Изобретение относится к гетероциклическим соединениям, в частности к получению производных резоруфина формулы 1а или 16 .СНЛ,С(0)ЦЦ ( где RI- Нили С1 в положении 2; H или С|-Сд-алкил; Кэ - Н, С(-С4-алкил или С1; Кд - Н или R -fR -аннелирован- ное фенильное кольцо; или 2; LI -N-CHu-CHu-N -CHu-CHfc, -N(CHs)-CHft-COO - или -С(0)-СН-СН,г-СНй-К-в свободном виде. 9 ил, -СН4-СНе;1,с-связь, -С(0)-(, где ,2 штиЗ, -NH-NHCHuCH 2-,-C(0)CHaCHe- -С(0)-, -С(0)СН(ОН)СН(ОН)С(0)-; А - радикал, образованный из гидан- тоина, дифенилгидантоина, трет-бутил- оксикарбонил-Ь-тироксина, фенобарбитала, эстрадиола, 7-теофиллина, диг гоксигенина, дигоксигенинмонодигиток- созида, З-амино-3-дезокситетраиодо- тироуксусной кислоты, тироксинметило- вого эфира или ксантина, причем радикал - (CH$)m-C(O)-L4-L$-A при находится в положении 4 и при - в положении 2, а в случае и п 0,8-6,4 L Н(СНа)СН«Ј(0) - или -С(О) - CH-CH -CHfc-N-CH -CHfc; Le - простая связь и А - радикал, образованный из иммуноглобулина G, которые являются флуоресцирующими метками низкомолекулярных или высокомолекулярных соединений. Цель - разработка способа получения указанных соединений. Получение ведут из соединения формул 1а и 16, где , вместо заместителя LЈA имеется реакционноспособный радикал , С1 или -О- -N-C(0)-CH$-CH2-C(0), и соединения формулы X4L(jA, где L. jj А - укаэа- но выше; Х4 - Н или (0)-CHg- (О), причем активные радикалы соединений могут иметь защитные группы, которые при необходимости удаляют с выделением целевого продукта (Л в свободном виде. 9 ил, 1 табл. Од Ю 00 04
2-(СН2)даС(0)Ъ1Ъ2
ОН
R« - Н или С1 в положении 2;
R$ - И или О -С 4гаякия;
Кэ- Н, СЦ-Сд-алкил или С1;
R4 - Н или Ra и R вместе образуют аннелированное фенильное кольцо,
или 2;
п-1,
Целью изобретения является полу ние новых производных резоруфина о щей формулы It которые в качестве флуоресцирующих меток низкомолекул ных или высокомолекулярных соедине позволяют повысить чувствительност и точность определения концентраци 30 компонентов проб крови.
Поставленная цель достигается т
О 35
,-J- ,
СНЭ .
кт OTJ -ГПГГ пап- V-C- что соединение общей формулы Ila UU ,tWi/ 1N /у или 116
СН3
L к- сЬязь . - С - (СНо)л 21
О где ,2шиЗ,
-NH-,- NHCH2CH2-1
О
40
45
(
О
он i
о Т о
-ССН2СН2С-,-ссН(он)сн(ОН)с-R
IIII 4о
А - радикал, образованный из ги- 5° где R«-R4, m и Ъ, имеют указанные дантоина, дифенилгидантоина,вьшв значения
трет-бутилоксякарбонил-L-тироксина, фенобарбитала, эстра- диола, 7-теофиллина, дягокси- генина, дигоксигенинмоноди- гитоксозида, 3-аминогЗ-дезок- ситетрайодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфиi L | - простая связь и А - радикал, образованный из иммуно- глобулина G,
которые являются флуоресцирующими метками низкомолекулярных или высоко- Молекулярных соединений и могут быть использованы в медицине в флуоресг центном иммуноанализе для определения концентрации гаптека или антигена в пробе крови.
Целью изобретения является получение новых производных резоруфина общей формулы It которые в качестве флуоресцирующих меток низкомолекулярных или высокомолекулярных соединений позволяют повысить чувствительность и точность определения концентрации компонентов проб крови.
Поставленная цель достигается тем,
что соединение общей формулы Ila или 116
О
40
(,
О
WH CLjXj
он i
о
подвергают взаимодействии с соединением общей формулы III
jXal А
где Ьг и А имеют указанные выше значения;
О.
Н или
-о0
:я
причем активные радикалы соединений Ila или 116 и III могут иметь защит- ные группы, которые при необходимости удаляют, с выделением целевого продукта в свободном виде.
На фиг. 1 - 9 представлены кривые, поясняющие способ.
Пример 1. з-(1-Дифенилгидан- тоииил)пронионил пиперазид резоруфин- 4-карбоновой кислоты.
а. Резоруфин-4-карбоновая кислота.
16 г нитрозорезорцина, 15,5 г 2,6- диоксибензойной кислоты и 8,6 пиролюзита суспендируют в 200 мл метилового спирта, после чего суспензию охлажца- ют до . Затем к суспензии прибавляют по каплям 10,6 мл концентрирован ной серной кислоты, после чего смесь дополнительно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Выде- ливиуюся в виде окрашенного в красный цвет осадка резапурин-4-карбоно- вую кислоту отфильтровывают, промывают метиловым спиртом и Ъушат.
Производное диазорезорцина растворяют в 200 мл воды и 50 мл 25%-ного раствора аммиака и раствор фильтруют. К окрашенному в голубой цвет фильтрату при охлаждении льдом прибавляют порциями 50 г цинковой пыли, причем реакционной смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры. За ходом восстановления легко следить с помощью хроматографии в тонком слое (элюирующее средство:метиловый спирт - этиловый эфир уксусной кислоты в соотношении 1:1; DC-пластины с силика- гелем). Реакционный раствор фильтруют, а затем фильтрат подкисляют ледяной уксусной кислотой и небольшим количеством концентрированной соляной кислоты. Выделившуюся в осадок резоруфин- 4-карбоновую кислоту отфильтровывают и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора.
Выход 16,33 г.
16218116
Rf (силикагель, элтоирующее средство: н-бутиловый спирт - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1: : ,4.
0
5
c
0
5 0
$ 0
б.Н,0,0-Триацетилдигидрорезору- фин-4-карбоновая кислота.
12,9 г резоруфин-4-карбоновой кислоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и 30 мл ангидрида уксусной кислоты, раствор смешивают с 27,6 г хлорида олова (II), после чего смесь перемешивают в течение 1 ч при 80°С. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл воды со льдом, производят перемешивание в течение 1 ч, после чего осадок отфильтровывают. После сушки твеодое вещество растворяют в 500 мл ацетона. Раствор фильтруют и фильтрат упаривают, в результате чего получают после сушки 11,3 г продукта.
Н-ЯМР(Д 4-ДМСО),(У: 2,24, 2,26 и 2,29 (по S, 9H); 6,94 (dd, ,5 и 2,2 Гц, 1Н); 6,98 (d, ,2 Гц, 1Н); 7,04 (d, Гц, 1Н); 7,61 (d, J 8,5 Гц, 1Н); 7,67 (d, Гц, 1Н) .
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,46.
в.Хлорангидрид Н,0,0-триацетил- дигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.
38,5 г триацетата, описанного в примере 16, смешивают с 54 мл окса- лилхлорида и смесь охлаждают до 0°С. К охлажденной смеси прибавляют несколько капель диметилформамида, после чего смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры. При этом растворение твердого вещества сопровождается выделением газа. Реакционную смесь упаривают в вакууме досуха, по ТРИ раза продукт растворяют в 200 мл сухого хлористого метилена и раствор вновь упаривают досуха.
Выход 41 г.
г.N-трет-Бутилоксикарбонил (БОК)- пиперазин.
12,61 г N-бензгидрилпипераэина (EMPA-cheraie) растворяют в 100 мл смеси 1,4-диоксана и воды, взятых / в соотношении 3:t. К приготовленному раствору прибавляют по каплям раствор 12,0 г ди-трет-бутилдикарбоната в
50 мл 1,4-диоксана. Смесь перемешивают в течение 0,5 ч, затем прибавляют к ней по каплям 50 мл волы, фильтруют, после чего осадок сугаат,
Выход 16,2 г N-БОК-м -бензгидрил- пиперазина.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,92.
7 г N-BOK-N -бенэгидрилпиперазина растворяют в 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Производят гидрирование в присутствии 0,3 г палладия на активированном угле, после чего катализатор отфильтровывают, а фильтрат упаривают. Полученный остаток смешивают со 100 мл воды и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты, фильтруют, фильтрат дважды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, а затем водную фазу доводят до основной реакции путем прибавления раствора гидро- окиси натрия. Выделившийся в осадок маслообразный продукт экстрагируют дихлорметаном. После сушки органической фазы над сернокислым натрием и упаривания получают 3,2 г N-БОК-пипе- разина в виде маслообразного вещества которое спустя несколько суток полностью закристаллиэовывается.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная ук- сусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,05 с нингидрином становится синим.
д.N -Бок-пиперазид Ы,0,0-триаце- тилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты.
К 25 г хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, и 17,3 мл три- этиламина в 450 мл дихлорметана при 0°С прибавляют по каплям раствор 13,8 г N-БОК-пиперазина в 50 мл ди- хлорметана. Реакционную смесь дополнительно перемешивают в течение 1 ч без охлаждения, затем три раза экстрагируют водой, после чего органическую фазу упаривают.
Выход 36,0 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,64.
е.N -БОК-пиперазид N-ацетилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты,
34,3 г триацетата, описанного в примере 1д, и 17,1 г сульфита натрия
0
5
0
5 Q
0
с
0
перемешивают в течение 1 ч при в 500 мл смеси 1,4-диоксана и воды, взятых в соотношении 1:1. После этогс реакционную смесь упаривают, остаток растворяют в этиловом эфире уксусной кислоты, раствор отфильтровывают от нерастворимой соли, после чего фильтрат хроматографируют на 2 л силика- геля (элюирующее средство:этиловый эфир уксусной кислоты - дихлорметан в соотношении 4:1, как только начинает вымываться продукт, переключаются на чистый этиловый эфир уксусной кислоты) .
Выход 14 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: этиловый эфир уксусной кислоты - дихлорметан в соотношении 4:1)0,28.
ж.N -БОК-пиперазид резоруЛин-4- карбоновой кислоты.
5 г N-ацетильного соединения, описанного в примере 1е, растворяют в 200 мл метилового спирта и 600 мл воды. К приготовленному раствору прибавляют 1,8 г кислого углекислого натрия и 10,7 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, а затем 14 г калийгексациа- ноферрата. Реакционную смесь перемешивают в течение 0,5 ч при комнатной температуре, после чего рН смеси доводят до 5. Выделившийся в осадок продукт отфильтровывают с применением вакуума.
Выход 2,72 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,28.
з.Трифторацетат пипераэида резору- фин-4-карбоновой кислоты.
1 г БОК-проивводного, описанного в примере 1ж, выдерживают в течение 15 мин в 20 мл трифторуксусной кислоты. Затем реакционную смесь упаривают, остаток обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают .
Выход 0,96 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,02.
и. Взаимодействие пиперазида резо- руфин-4-карбоновой кислоты с N-окси- сукцинимидным эфиром 3-(1-дифёнилги- дантоинил)пропионовой кислоты.
191 мг трифторацетата, описанного в примере 1з, и 210 мг N-оксисукцини9162181
мидного эфира 3-(1-дифенилгидантои- нил)пропионовой кислоты (получен из | натриевой соли дифенилгидантоина и этилового эфира 3-бромпропионовой кислоты) перемешивают в течение 15 ч в 20 мл диоксана и 20 мл О,1 М калий- фосфатного буферного раствора с рН 8,5. Выделившийся в осадок продукт отфильтровывают, фильтрат упаривают ./, и хроматографируют остаток на сили- кагеле RP 18 (элюирующее средство: изопропиловый спирт), в результате чего получают дополнительное количество продукта. Продукт кристаллизуют 5 из смеси этилового эфира уксусной кислоты и метилового спирта, в результате чего суммарно получают 250 мг сопряженного продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средст-эд во: хлороформ-метанол ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,61.
н-ЯМР(д16-ДМСО),д: 2,6-2,8 (т, 2Н); 3,0-3,8 (т, ЮН); 6,74 (d, J 25 2,2 Гц, 1Н); 6,82 (d, ,5 Гц, 1Н); 6,91 (dd, ,5 и 2,2 Гц); 7,25-7,33 (т, ЮН), 7,55 и 7,66 (по d, ,5 Гц, 2Н) млн .
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный бу- 30 ферный раствор с рН 7,5):flMQKC 576,8 нм.
Эмиссия флуоресценции: 592 нм.
Пример 2. Взаимодействие пипе-г разида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 3-(1-ди- фенилгидантоинил)уксусной кислоты.
По аналогии с описанным в примере 1и из 365 мг трифторацетата пиперази 40 да резоруфин-4-карбоновой кислоты и 339 мг N-оксисукцинимидного эфира 3-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 210 мг (2-дифенилгидан- тоинилметилкарбонил)пипераэида резо- руфин-4-карбоновой кислоты.
Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,82.
Н-ЯМР (Д16-ЛМСО),Я: 3,2-4,5 (га, sn ЮН); 6,60 (d, ,4 Гц, 1Н).; 6,71 и (d, ,5 Гц, 1Н); 6,80 (dd, ,05 и 2,04 Гц, 1Н); 7,39 (S, ЮН); 7,52 (d, ,5 Гц, 1Н); 7,61 (d, ,0 Гц, 1Н); 9,65 (S, 1H) млн. .55
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): ,4 нм.
Эмиссия флуоресценции:fl макс 592 нм.
10
П р и м е р 3. Взаимодействие пи- перазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром N-BOK -L-тироксина.
По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг трифторацетата пипера- зида резофурин-4-карбоновой кислоты и 419 мг N-оксисукцинимидного эфира N-BOK-L-тироксина получают 320 мг продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,58.
N-Оксисукцинимидный эфир N-BOK-L- тироксина получают следующим образом.
а) N-BOK-тироксин.
Раствор 10 г (12,5 ммоль) натриевой соли L-тироксина з смеси, состоящей из 300 мл смеси диоксана и воды в соотношении 2:1 и 15 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, смешивают с 3 г (13,75 ммоль) ди-трет-бутил- дикарбоната (БОК)О, после чего реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре в условиях, исключающих доступ света.
Прибавлением 2 М раствора KHSO рН смеси доводят до 2, смесь экстрагируют этиловым эфиром уксусной- кислоты, экстракт, представляющий собой раствор продукта в этиловом эфире уксусной кислоты, промывают водой, сушат над сернокислым натрием и упаривают. Твердый остаток растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают продукт с применением вакуума и сушат в эксикаторе.
Выход 9,45 г (86% от теоретически рассчитанного значения).
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - лигроин - уксусная кислота в соотношении 6:3:1)0,6.
б. N-Оксисукцинимидный эфир N-БОК- тироксина.
К раствору 8,8 г L-БОК-тироксина в 200 мл диметилового эфира этилен- гликоля прибавляют 1,2 г (9,5 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаэдают до 10вС, после чего его смешивают по каплям с раствором 2,3 г (9,9 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 40 мл диметилового эфира этиленгликоля. Реакционную смесь перемешивают в тече-. ние 2 ч при комнатной температуре, . выделившуюся в осадок дициклогексилмо- чевину отфильтровывают с применением вакуума, после чего фильтрат упариваП16218
ют в вакууме лри 40СС. Полученный остаток растирают с иэопропиловым спиртом и отфильтровывают с применением вакуума, а затем сушат в эксикаторе при комнатной температуре.
Выход 9,19 г Ы-(№-ВОС-Ь-тироксин) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (94% от теоретически рассчитанного значения), общий выход по отноше-,,. нию к тироксину 81%.
Rf (HPTLC-RP 18; элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 9:1)0,8 или (HPTLC-RP 18; элюирующее средство; ацетонитрил - вода в COOT- jj ношении 8:2)0,6.
Н-ЯМР f(U ЛМСО) ,): 1,36 (S, 9H); 2,81 (S, 4H); 2,9-3,2 (m, 2H); 4,5- 4,9 (та, 1Н); 7,08 (S, 2H); 7,63 (d, Гц, 1Н); 7,90 (S, 2Н); 9,2 (S, 20 1Н) млн- .
Пример4. Сопряжение пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с 3-0- 3-(М-сукцинимидоксикарбонил)про- пил экстрадиолом.25
По аналогии с описанными примере 1и из 212 мг трифторацетата пиперазида реэофурин-4-карбоновой кислоты и 220 мг 3-0- СЗ-(М-сукцинимидилоксикар- бонил)пропил} эстрадиола получают 30 295 мг (З-карбонил)пропил эстрадиолилпиперазида резоруфин-4- карбоновой кислоты.
Rf (силикагель, элюирующеб средство: хлороформ - метанол - ледяная ук-,, сусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,58.
3-0-{.3-(ы-Сукцинимидоксикарбонил) пропил эстрадиол . получают обычным способом из 3-0-карбоксипропилэстра- 40 диола (получен из эстрадиола и бром- масляной кислоты), и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбоди- имида.
Пример 5. Сопряжение пиперази- е да резоруфин-4-карбоновой кислоты с N з-(К-сукцинимидоксикарбонил)пропил фенобарбиталом.
По аналогии с описанным в примере 1и из 212 мг трифторацетата пиперазида , резоруфин-4-карбоновой кислоты и 205 мг ((М-сукцинимидоксикарбо- ннл)пропил фенобарбитала получают 220 мг Јм-(3-карбонил)пропил фенобарбитала резоруфин-4-карбоновой кислоты..
55
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) -0.45.,
5
,.
j
0
5
0
,
0
е
5
112
N-L3-(N-Сукцинимидоксикарбонил) пропил фенобарбитал получают обычным способом из фенобарбитал-1-масляной кислоты и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбодиимида.
П р и м е р 6. Сопряжение пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром теофил- лин-7-пропионовой кислоты.
Из 212 мг трифторацетата пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты и 175 мг N-оксисукцинимидного эфира тео- филлин-7-пропионовой кислоты получают по аналогии с описанным в примере 1 и 200 мг М-(теофиллин-7-пропионил) пиперазида резоруфин-4-карбоновой кислоты
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,44.
N-Оксисукцинимидный эфир теофил- лин-7-пропионовой кислоты получают обычным способом из теофиллин-7-про- пионовой кислоты и N-оксисукцинимида в присутствии дициклогексилкарбодиимида.
Пример 7. Сопряжение N-оксисукцинимидного эфира Ы-(4-реэоруфи- нил-карбонил)саркозина с 1-(2-амидо- этил)дифенилгидантоином.
а.(трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид Н,0,0-триацетилдигидрорезору- фин-4-карбоковой кислоты.
10 т хлорангидрида кислоты, описанного в примере 1в, вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1д с трет-бутиловым эфиром саркозина.
Выход 7,5 г.
Rf (силикагель, .элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,77.
б.(трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид Н-ацетилдигидрорезоруфин-4- карбоновой кислоты.
7,5 г продукта, описанного в примере 7а, деацетилировали по анлогии с описанным в примере 1ж.
Выход 5,2 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная .уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,56.
в.- (трет-Бутоксикарбонилметил)ме- тиламид резоруфин-4-карбоновой кислоты.
4,5 г продукта, описанного в приере 76, вводят во взаимодействие по налогии с описанным в примере 1ж.
Выход 2,6 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,t) 0,64.
г.N-(карбоксиметил)метиламид резо1 уфин-4-карбоновой кислоты.
0,55 г продукта, описанного в приере 7в, выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре в 6 мл три- торуксусной кислоты Затем реакционную смесь упаривают досуха, остаток растирают с диэтиловым эфиром, после чего продукт отфильтровывают.
Выход 0,45 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)- -О, И.
д.N -оксисукцинимидный эфир N-(4- резоруфинилкарбонил)саркоэина.
200 мг продукта из примера 7 в те- чение 14 ч перемешивают с 72 мг N-ок- сисукцинимида и 138 мг дициклогексил- карбодиимида в 40 мл тетрагидрофурана Выделившуюся в осадок мочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают и полученный остаток хроматографируют на силикагеле RP 18 (элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1).
Выход 150 мг.
Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,79.
е.Сопряжение N -оксисукцинимидно- го эфира М-(4-резоруфинилкарбонил)сар Козина с 1-(2-аминоэтил)дифенилгидан- тоином.
125 мг N-оксисукцинимидного эфира из примера 7д перемешивают в течение 1 ч с 90 мг 1-(2-аминоэтил)дифенил- гидантоина в 40 мл смеси, состоящей из диоксана и калийфосфатного буферного раствора с рН 8,5, взятых в соот ношении 1:1. Диоксан отгоняют от реакционной смеси, к остатку прибавляют аммиак до полного изменения цвета, производят фильтрование, после чего из фильтрата осаждают продукт прибавлением соляной кислоты.
Выход №-(4-резоруфинкарбонил)сар- косинил-1-(2-аминоэтил)дифенилгидан- тоина 110 мг.
5
0
5
0
5
5
0
5
Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,78.
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0) :/lNvavt ; 575 нм.
Эмиссия флуоресценции:fl нлцс т 572 им.
Примерв. 2-(1-Дифенилгидан- тоинил)этиламид резоруфин-4-карбоно- вой кислоты.
а.2-(1-Дифенилгидантоинил)этил- амид К,0,0 триацетилдигидрорвзоруфин- 4-карбоновой кислоты.
По аналогии с описанным в приме- ipe 1д 1,37 г 1-(2-аминоэтил)дифенил- гидантоина вводят во взаимодействие с 1,2 г хлорангидрида М,0,0-триацетилт дигидрорезоруфинкарбоновой кислоты. В результате получают 1,9 г продукта в виде слабо окрашенного пенообразного вещества.
б.2-(1-Дифеннлгидантоинил)этил- амид резоруфин-4-карбоновой кислоты.
Полученный в примере 8а продукт окислительно деацетилируют по аналогии с описанным в примерах 1е и 1ж. Из 1,9 г вещества получают 600 мг N- 2т( 1-дифенилгидантоинил) этил резог руфин-4-карбоновой кислоты.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,68.
Н-ЯМР ( -ДМСО),У: 3,2-4,6 (т, 4Н); 6,73 (d, ,2 Гц, 1Н); 6,84 (d, ,5 Гц, tH); 6,86 (dd, ,5 и 2,2 Гц, 1Н); 7,2-7,4 (т, ЮН); 7,62 и 7,66 (по d, ,5 Гц, 2Н); 8,66 (t, широкий, Гц, 1H)j 9,58 (S, 1Н) млн- .
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0): 575 нм.
Эмиссия флуоресценции: дк 591 нм.
Пример 9. Сочетание пиперази- да 6-метилрезоруфин-4-карбоновой кислоты с N-окснсукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.
а. 2-Метил-4-нитрозорезорцин.
19,8 г 2-метилрезорцина и 13,4 г гидроокиси калия растворяют в 120 мл этилового спирта, после чего раствор охлаждают до 5°С„ После этого к : охлажденному раствору прибавляют по каплям 24 мл изопентилнитрила, смесь
перемешивают в течение Зч, после чего отфильтровывают образовавшийся осадок. Окрашенное в желтый цвет твердое вещество перемешивают в - 200 мл 5 н. раствора серной кислоты. При этом в осадок наделяется окрашенный в светло-желтый цвет продукт.
Выход 22 г.
Rf (силикагель, элюирующее средст-tO во: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) «0,53.
б.6-Метилрезапурин-4-карбоновая кислота.15
15,3 г 2 метил-4-нитроэореэорцина, 15,4 г 2,6-диоксибензойной кислоты, 8,8 г пиролюзита и 11 мл концентрированной серной кислоты вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в 20 примере 1а.
Выход 28,7 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1)5 0,15.,
в.Н,0,0-Триацетил-6-метилдигидро- резоруфин-4-карбоновая кислота.
Из 10 г 6-метилрезапурин-4-карбо- новой кислоты, 19,8 г хлорида оло-. 30 ва (II), 20 мл ангидрида уксусной кислоты и 150 мл ледяной уксусной кисло ты получают по аналогии с описанным в примере 16 непосредственно триацети- лированное лейкосоединение. Неочищен- ,5 ный продукт очищают путем обработки кипящим ацетоном.
Выход 7,3 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная 40 уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,51. Q
Н-ЯМР (д 6-ДМСО),0: 2,10; 2,25; 2,29; 2.33 (по 12Н); 7,00; 7,09; 7,50 и 7,74 (по d, ,8 Гц, 4Н) . $
г.N -BOK-пипераэид N1 ,0,0-триаце- тил-6-метилдигидрорезоруфин-4 карбо- новой кислоты.
По аналогии с описанным в примерах 1г и 1д из 5 г К,0,0-триацетил-6-ме- JQ тилдигндрорезоруфин-4-карбоновой кислоты, 10,7 мл оксалилхлорида и 2 г (N-БОК-пиперазина получают 3 г продукта .
Rf (силикагель, элюирующее средст-55 во: этиловый эфир уксусной кислоты) «0,57.
д.Трифторацетат пиперазида 6-ме- тилреэоруфин-4-карбоновой кислоты.
1 г триацетильного производного, описанного в примере 9г, вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примерах 1ж и 1з.
Выход 0,43 г.
е. Взаимодействие пиперазида 6-ме- тилрезоруфин-4-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром 2-( фенилгидантоинил)уксусной кислоты.
222 мг соединения, полученного в примере 9д, вводят во взаимодействие с 200 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты.
Выход N- (1-дифенилгидантоинил)ме- тилкарбонил пиперазида 6-метилрезору- фин-4-карбоновой кислоты 250 мг.
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буфер раствор, рН 8,0): $waKC 584 нм.
Эмиссия флуоресценции: avtc 600 нм.
Пример 10. Взаимодействие пиперазида 9-окси-5-бензоЈа феноксазон- 8-карбоковой кислоты с N-оксисукцини- мидным эфиром 2-(1-дифенил-гидантои- нил)уксусной кислоты.
а.12-Оксид 9-окси-5-бензоСа фе- ноксазон-8-карбоновой кислоты.
2,84 г 1,3-диокси-4-нитрозонафтали- на, 2,31 г 2,6-диоксибензойной кислоты, 1,29 г пиролюзита и 1,6 мл концентрированной серной кислоты вводят во взаимодействие по аналогии с описанным в примере 1а.
Выход 2,8 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,63.
б.12-Ацетил-5,9-диацетоксибен- зо СаЗ феноксазон-8-карбоновая кислота.
По аналогии с описанным в примере 9в из 2,4 г 12-оксида Э-окси-5- бензо д феноксазон-8-карбоновой кислоты получают 1,8 г триацетилированного дигидросоединения.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0.31.
в.М -БОК-пиперазид 12-ацетил-5,9- диацетоксибензо(а}феноксазил-8-карбо- новой кислоты.
1,6 г триацетильного соединения, описанного в примере 106, вводят во взаимодействие по аналогии с примером -9г с оксалилхлоридом и N-БОК-пи- перазином.
Выход 1,2г.
5
Н-ЯМР (CDC19),: 1,49 (S, 9H): 1,12, 2,27, 2,46 (по S, 12H); 3,0- 3,9 (т, 8Н); 7,03 (d, Гц, 1Н); 7,16-7,94 (т, 6Н) .5
г.N - БОК-пиперазид 9-окси-5 бен- зо а 1феноксазон-8-карбоновой кислоты.
По аналогии с примером 1е из 0,93 г триацетильного соединения, полученного в примере 10в, получают 10 0,51 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующве средство; хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,69.5
д.Трифторацетат пиперазида 9-ок- си-5-бензо а1феноксазон-8-карбоновой кислоты.
Из 0,5 г БОК-эащищенного соединения, описанного в примере Юг, по 20 аналогии с примером 1з получают 0,5 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,02.
е.Сопряжение пиперазида 9-окси-5- бензоЈа феноксазон-8-карбоновой кислоты с N-оксисукцинимидным эфиром
2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кис- ™ лоты.
Из 50 мг пиперазида, полученного в примере 10д, и 150 мг N-оксисукци- нимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил) уксусной кислоты получают по ано- 35 логии с примером 1и 70 мг N-Ј( 1-дифенилгидантоинил )метилкарбонилЗпиперазида 9-окси-5 бензо а2Феноксазон-8- карбоновой кислоты.
40
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотногаении 9:1: ;0,1)-0,57.
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный бу- 45 ферный раствор, рН 8,0): $мйкс 560 нм.
Эмиссия флуоресценции: yi маке 615 нм.-.
Н-ЯМР (Сд 6-ЛМСО),д: 3,0-4,5 (m, SQ ЮН); 6,37 (S, 1H); 6,80 (d, Гц, и 1Н); 7,2-7,35 (т, ЮН); 7,35-8,0 (га, ЗН); 8,10 (dd, и 2 Гц, 1Н); 8,56 (dd, Гц, 1Н); 9,60 (S, 1H) .55
Пример 11. (1-Дифенилгиданто- инилметилкарбонил)пиперазид 8-этилре- эоруфин-4-карбоновон кислоты.
а. 6-Этил-4-нитрозорезорцин.
По аналогии с описанным в примере 9а из 7,5 г 4-этилрезорцина, 4,5 гидроокиси калия и 8 мл изопентилнитри- ла получают 6-этил-4-нитрозорезорцин в виде окрашенного в желтый цвет твердого вещества.
Выход 7,5 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1: :0,1)0,37.
б.8-Этилрезоруфин-4-карбоновая кислота.
По аналогии с описанным в примере 1а из 7,4 г 6-этилнитрозореэор- цина, 6,8 г 2,6-диоксибенэойной кислоты, 3,9 г двуокиси марганца и 5 мл концентрированной серной кислоты получают после восстановления с применением 8 г цинковой пыли 9,5 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,05. t
в.N -БОК-пиперазид Ы,0,0-триаце- тил-8-э тилдигидр оре з оруфин-4-кар боно- вой кислоты.
По аналогии с примером 16 из 7,7 г 8-этилрезоруфин-4-карбоновой кислоты, 15,4 г хлорида олова (II), 30 мл ле- дяной уксусной кислоты и 15,3 мл ангидрида уксусной кислоты получают N,0,О-триацетил-8-этилрез оруфин-4-кар- боновую кислоту, которую в виде неочищенного продукта подвергают дальнейшей переработке по аналогии с примером 1в непосредственно в хлорангид- рид кислоты и по аналогии с приме- ром 1д - в БОК-пиперазид.
Выход 4г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,86.
г.N -БОК-пиперазид 8-этилрезору- фин-4-карбоновой кислоты.
Из 4 г N -БОК-пиперазида ы ,0,0- трнацетнл-8-этилдигидро езоруфин-4- карбоновой кислоты получают по аналогии с примерами 1е и 1х N -БОК-пиперазид соответствующей карбоновой кислоты.
Выход 0,5 г.(
Rf (силикагель, элюирующее средст во: хлороформ - метанол - в соотношении 4:1)0,67.
д.Трифторацетат пиперазида 8-этил- резоруфин-4-карбоновой кислоты.
330 мг соответствующего БОК-пипе- разида выдерживают в течение 1,5 ч в 35 мл смеси, состоящей из дихлор- метана и трифторуксусной кислоты, вэя- тых в соотношении 6:1. Полученный после упаривания остаток обрабатывают днэтиловым эфиром, продукт отфильтровывают с применением вакуума и сушат..
Выход 350 мг.
Rf (силикагель, элюирукнцее средство: бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1-: 1)0,33,
е. Взаимодействие с N-оксисукцин- имидным эфиром 2-(1-дифенилгидантои- нил)уксусной кислоты.
По аналогии с примером 1 и из 325 мг трифторацетата пиперазида 8- этилрезоруфин-4-карбоновой кислоты 2 и 435 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают 120 мг продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная 2 (уксусная кислота в соотношении 9:1:
:0,1)0,43. .
н-ЯМР (д6 -ДМСО),д: 1,15 (t, J 7,2 Гц, ЗН); 2,52 d, ,2 Гц, 2Н); 3,1-4,0 (т, 8Н); 4,25-4,45 (т, 2Н); 3 6,42 (S, широкий, 1Н); 6,94 (d, J 9,0 Гц, 1Н); 7,3-7,5 (S, 11H); 7,68 (d, ,0 Гц, 1Н); 9,54 (S, 1H); 11,2 (S, широкий, 1Н) млн .
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буфер-, ный раствор, рН 8,0) :Яма)С(575 нм.
Эмиссия флуоресценции: $MOW нм.
Пример 12. (1-Дифенилгиданто- инилметилкарбонил)пиперазид 8-хлор- д резоруфин-4-карбоновой кислоты.
а.8-Хлорреэапурин-4-карбоновая кислота.
Из 17,3 г 4-хлор-6-нитрозорезорци- на, 15,4 г 2,6-диоксибензойной кислоты, 8,6 г пиролюзита и 10,7 мл концентрированной серной кислоты получают по аналогии с примером 1 а 8-хлор- резапурин-4-карбоновую кислоту.
Выход 17,1г.e
Rf (силикагель, элюирующее средство: бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,58.
б.М,0,0-Триацетил-8-хлордигидро- резоруфинкарбоновая кислота. е
16,3 г 8-хлоррезапурин-4-карбоно- вой кислоты и 18,9 г хлорида олова (II) нагревают в течение 0,5 ч в 100 мл смеси ледяной уксусной кислоты
и ангидрида уксусной кислоты, взятых в соотношении 1:1 при 80°С, после чего реакционную смесь выливают в 500 мл воды со льдом. Смесь перемешивают в течение 2 ч, осадок отфильтровывают и сушат над Sicapent . Твердое вещество растворяют в 500 мл ацетона, после чего от раствора отделяют фильтрованием остатки нерастворенного вещества. Фильтрат упаривают, причем после сушки остатка получают 12,3 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,39.л
ГН-ЯМР (д16-ЛМСО), О: 2,25 (S, ЗН); (S МО; 7,16 (d, ,8 Гц, Ш) 7,30 (S, 1Н); 7,76 (d, ,8 Гц, 1Н); 7,90 (S, 1H) млни .
в.N -БОК-пиперазид 8-хлоррезору- фин-4-карбоковой кислоты.
По аналогии с примерами 16, 1в, 1д и 1ж из 5 г М,0,0-триацетил-8-хлор дигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты получают 0,8 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,7.
г.Трифторацетат пиперазида 8-хлор- резоруфин-4-карбоновой кислоты.
По аналогии с примером 1з из 0,8 г БОК-защищенного соединения, полученного в примере 12в, получают 0,81 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в роотногаении 9:1:0,1) 0,07.
д.Сопряжение пиперазида 8-хлор- реэоруфин-4-карбоновой кислоты с N- оксисукцинимидным эфиром 2-(1-дифенилгидантоинил) уксусной кислоты.
По аналогии с примером 1и из 400 мг трифторацетата пиперазида 8- хлоррезоруфин-4-карбоковой кислоты и 410 мг N-оксисукцинимидного эфира 2-(1-дифенилгидантоинил)уксусной кислоты получают желаемый продукт.
Rf (силикагель, элюирующее средство: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,38.
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,0) : нм.
Эмиссия флуоресценции: $какс 597 нм.
Пример 13. Сопряжение пипера- эида 8-хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с (2-аминоэтил)амидом теофиллин- 7-пропионовой кислоты.
а.8-Хлоррезоруфин-1-карбоновая кислота.
8,7 г 4-хлор-6-нитрозорезорцина и 7,71 г 3,5-диоксибензойной кислоты растворяют в 200 мл метилового спирта. К приготовленному раствору при прибавляют 4,8 г пиролюзита и порциями 5,3 мл концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, фильтруют и прибавляют к раствору аммиак до изменения окраски на голубую, а затем 200 мл воды. Раствор фильтруют, фильтрат при охлаждении смешивают с 25 мл концентрирован- 2 ного раствора аммиака и 20 г цинковой пыли, после чего смесь дополнительно перемешива ют без охлаждения примерно в течение 15 мин. Затем к смеси прибавляют 200 мг активированного угля, 2 производят фильтрование, фильтрат подкисляют до рН 2, после чего выделившееся в осадок производное разоруфина отделяют с помощью центрифугирования .3
Выход 3,9 г.
Rf (силикагель, элюирующее средство: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:1)0,88.
б.N,0,0-Триацетил-8-хлордигидр о- резоруфин-1-карбоновая кислота
Из 3,5 г 8-хлоррезоруфин-1-карбо- новой кислоты по аналогии с примером 16 получают 3,2 г продукта. t Rf (силикагель, элюирующее средст-4 во: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,43.
в.Трифторацетат пипераэида 8-хлор- резоруфин-1-карбоновой кислоты.
Из 3 г триацетильного соединения, полученного в примере 116, по аналогии с примерами 1в - 1з получают 1,4 г продукта.
Rf (силикагель, элюирующее средст- 5 во: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 9:1:0,1) 0,08.
г.Взаимодействие пиперазида 8- хлоррезоруфин-1-карбоновой кислоты с с (2-аминоэтил)амидом теофиллин-7-про- пионовой кислоты.
По аналогии с примером 8 из 420 мг . пиперазида К,0,0-триацетил-8-хлорди3
Q 5 0 5 0
д
5
О
г
5
гидрорезоруфин-1-карбоновой кислоты и 300 мг (2-аминоэтил)амида теофял- лин-7-пропионовой кислоты получают 190 мг N-С(теофиллин-7-пропионил)- 2-аминоэтил амида 8-хлоррезоруфин- 1-карбоновой кислоты.
Пример 14. Мечение иммуноглобулина G N-оксисукцинимидным эфиром N-(4-резоруфинилкарбонил)саркозина.
100 мг IgG человека растворяют в 10 мл 0,1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,0, после чего приготовленный раствор смешивают с 5 мг Н -оксисукцинимидного эфира N-(4-pe- эоруфинилкарбонил)саркозина (пример 7д). Реакционную смесь выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем хроматографирукт на Ultrogal АСА 202 (LKB) Ы-(4-реэоруфи- нилкарбонил)саркозинил-иммуноглобулин. При этом меченый белок вымывается до свободного низкомолекулярного резо- руфина. Степень мечения определяют с помощью измерения экстинкции. Она составляет 3, т.е. молекула IgG связана с тремя молекулами производного резоруфина.
П р и м е р 15. Мечение иммуноглобулина G N -оксисукцинимидным эфиром (4-резоруфинилкарбонил)пиперидин-4- карбоновой кислоты.
а.К1-(4-Резоруфинилкарбонил)пипе- ридин-4-карбоновая кислота.
2,0 г хлорангидрида Н,0,0-триаце- тилдигидрорезоруфин-4-карбоновой кислоты, описанного в примере 1в, по аналогии с примером 1д вводят во взаимодействие с 0,9 г гидрохлорида метилового эфира пиперидин-4-карбоновой кислоты, по аналогии с примерами 1е и 1ж производят деацетилирование и окисление, после чего продукт омыляют раствором гидроокиси натрия до N-(4-резоруфинилкарбонил) -пиперидин-4-карбоно- вой кислоты.
Выход 0,9 г.
Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,44.
УФ/VIS (0,1 М калийфосфатный буферный раствор, рН 8,5): л/цацс.576,2 нм.
б.N -оксисукцинимидный эфир N-(4- р е зор уфинил кар бонил ) -пип еридин-4-кар- боновой кислоты.
Из 200 мг №-(4-реэоруфинилкарбо- кил)пиперидин-4-карбоновой кислоты, 240 мг (N-оксисукцинимида и 468 мг ди- циклогексидкарбодиимида получают по
аналогии с примером 7д 190 мг продукта .
Rf (силикагель RP-18, элюирующее средство: нитрометан - этанол в соотношении 4:1)0,7.
ИК (прессованный с бромистым калием образец):3415 (га, широкий), 1814 (т), 1773 (т), 1734 (S), 1626 (т), 1214 (га) .,
в. Мечение IgG кроликов N -окси- сукцинимидным эфиром №-(4-резоруфинил- карбонил)пиперидин-4-карбоновой кислоты.
10 мг IgG кроликов в 1 мл О,1 М калийфосфатного буферного раствора с рН 8,5 смешивают со 100 мкл раствора 1,9 мг N-оксисукцинимидного эфира И-(4-резоруфинилкарбонил)пиперидин- 4-карбоновой кислоты в 1 мл 1,4-диок- сана, после чего приготовленную смесь выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. Это отвечает молярному соотношению производного резору- фина и IgG кроликов 6,4:1. 2
После хроматографирования на АСА 202 (элюирующее средство: 0,1 М калий- фосфатный буферный раствор, рН 8,5) получают фракцию белка, которая имеет отношение поглощений А578/А$70 0,97, з соответственно степень нагрузки
кроликов смешивают с 20 мкл раствора активированного резоруфина, то при
Максимум поглощения меченного резо- руфином IgG около 578 нм. Раствор дает сильную флуоресценцию светло- красного цвета.
Если раствор меченного резоруфи- ном IgG в течение месяца подвергают воздействию дневного света, то интенсивность флуоресценции уменьшается до 59% от первоначального значения, в то время как аналогично полученный, но меченный флуоресцениизотиоцианатом IgG уменьшает интенсивность до 16%, а меченный красителем Texas Rot IgG - до 12%.
Пример 16. Определение ди- фенилгидантоина в сыворотке человека с помощью ФНИА.
1950 мкл (0,1 М натрийфосфатного буферного раствора (рН 7,8) смешивают с 5 мкл пробы (1), 25 мкл раствора антитела (2) и 25 мкл раствора дифенил5
- 5
о
О
5
гидантоин-резоруфина (3). Смесь выдерживают в течение 5 мин при 37°С, а затем измеряют флуоресцентную поляризацию (длина возбуждающей волны 575 нм, длина излучаемой волны 594 нм, измерительный прибор - флуоресцентный спектрометр 650-10 Хитачи).
Антитела получают обычным способом посредством иммунизации овец дифенил- гидантоином, который связан с альбумином сыворотки крови крупного рогатого скота.
Антисыворотку очищают с помощью осаждения сульфатом аммония и хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.
0,1 М натрийфосфатном буферном растворе (рН 7,8).
Результаты измерений, которые получают с растворами дифенилгидантоина 1а, 16, 1в, 1г и 1д, представлены на фиг. 1.
С помощью такой калибровочной кривой также могут быть определены концентрации дифенилгидантоина в пробах с неизвестным содержанием дифенилгидантоина.
Аналогичные калибровочные кривые также могут быть получены в тех случаях, когда вместо примененного выше конъюгата дифенилгидантоина из примера 1 применяют конъюгаты дифенилгидантоина из примеров 2,7,8 или 10е.
На фиг. 2 - калибровочные кривые, полученные при применении конъюгата (1-дифенилгидантоинилметилкарбонил)пи- перазида резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 2); на фиг. 3 - то же, конъюгата М-(4-резоруфинилкарбонил) саркосинил-1-(2-аминоэтил)-дифенилгидантоина (пример 7); на фиг. 4 - то же, конъюгата 2-(1-дифенилгиданто- инил)этиламида резоруфин-4-карбоновой кислоты (пример 8); на фиг. 5 - то же,
25162
конъюгата 2-(1-дифенилгидантоинил)пи- перазидметилкарбонил.-пиперазида 9-окси-5-бензоЕаЗ-феноксазон-8-кар- боновой кислоты (пример 10).
Пример 17, Определение актив- ности эндогликозидазы резоруфин-высо- команнозным гликопептидом.
а.Мечение высокоманнозного глико- пептида Мг-оксисукцинимидным эфиром М-(4-резоруфинилкарбонил)-саркозина.
50 мг высокоманнозного гликопепти- да смешивают с 10 мл 0,1 М калийфос- фатного буферного раствора с рН 8,0. Раствор доводят до рН 8,0. Прибав- ляют к нему 25 мг м -оксисукцинимид- ного эфира М-(4-резоруфинилкарбонил) саркозина, растворенные в 3 мл диок- сана, через 1 ч еще раз прибавляют такое же количество N-оксисукцинимид- ного эфира красителя в 3 мл диоксана. Смесь перемешивают в течение 14 ч при комнатной температуре, затем производят отгонку диоксана в вакууме, после чего остаток разбавляют водой до 70 мл, а затем буферным раствором А (0,02М трис-HCl, 2 мМ хлористого магния, 2 мМ хлорида марганца (II), 2 мМ хлористого кальция, рН 7,2) до 140мл. Прибавлением водного раствора амми- ака рН доводят до 7,2. Образовавшийся при этом осадок отделяют центрифугированием. Находящуюся над осадком жидкость вводят в заполненную Con А-сефарозой колонку (1х х15 см). Свободный краситель вымыва- ют буферным раствором А. Как только протекающая жидкость теряет красную окраску, вымывают первую фракцию - реэоруфин-высокоманнозный гликопептид 2%-ным метилманнозидом в буферном растворе А в качестве элюирующего чсредства (приблизительно 100 мл). После этого элюируют вторую фракцию 2%-ным водным раствором метилманно- зида. Обе фракции подаергают диализу по отношению к воде и лиофилизуют. Обе фракции пригодны для описанного ниже определения активности эндогликозидазы „
б,Определение активности эндогликозидазы.
Резоруфин-высокоманнозный гликопептид выдерживают в подходящем буферном растворе с эндогликозидазой, например в цитратном буферном растворе с рН 5,5 с эндогликоэидазой Н (проба 1). Параллельно готовят пробу, не содержащую эндогликозидазы (проба 2)
11
26
.Q
20 25 , 30
0
40
5
После инкубации обе пробы смешивают с Con А-сефарозой, после чего пробы встряхивают для того, чтобы связался резоруфин-высокоманнозный гликопептид. Меченный резоруфином пептид, у которого в результате активности фермента отщеплен фрагмент сахара, не связывается. Через 15 мин Con А-сефарозу отделяют центрифугированием, находящуюся над осадком жидкость доводят до рН 7,5, после чего измеряют флуоресценцию (возбуждение, например, 550 нм, эмиссия 595 нм). Разница между пробой 1 и контрольным значением (проба 2) показывает количество расщепленного резо- руфин-высокоманнозного гликопептида и является, следовательно, мерой активности фермента.
Пример 18. Соединение диги- токсигенин-З-гемисукцинат-Ы-гидрок.и- сукциьимидэфира с резоруфин-4-пипера- зидом карбоковой кислоты.
438 мг реэоруфин-4-пиперазида кар- боновой кислоты и 570 мг дигитоксиге- нин-З-гемисукцинат-Ы-гидроксисукцини- мид-эфира вводят в 160 мл смеси диок- сан - вода 1:1. Раствор доводят до рН 8,5 5%-ным водным раствором карбоната калия и перемешивают 3 ч при комнатной температуре. Выпаривают ди- оксан, доводят до рН 1 и отсасывают осажденный продукт.
Выход 670 мг.
Rf (силикагель-HPTLC, средство текучести: бутанол - ледяной уксус - вода 4:1:1)0,64.
Rf резоруфин-4-пиперазид ка боно- вой кислоты 0,09.
Пример 19. Соединение резору- фина-4-пиперазида карбоновой кислоты с дигоксигенинмонодигитоксозид-(3Г- гемиглютарат)-N-гидроксисукцинимид- эфир ом.
Аналогично примеру 18 из 438 мг резоруфин-4-пиперазида карбоновой кислоты и 731 мг дигоксигенинмонодигиток- созид-(3 -гемиглютарат)-N-гидроксисук- цинимид-эфира получают 630 мг сырья. После хроматографии на силикагеле RP 18 (элюент:изопропанол - вода 2:1) получают 34 мг продукта.
Rf (силикагель-HPTLC, средство текучести: бутанол - ледяной уксус - вода 4:1:1)0,61.
Пример 20. Соединение N-(4- резоруфинилкарбонил)пиперидин-4-карбо- новой кислоты-N -гидроксисукцинимидэфира с З-амнно-3-дизоксидигоксиге- нином.
140 мг 3 амнно-3-дезоксидигоксиге- нина и 140 мг Ы(4--резоруфинилкарбо- нил)ггиперидин-4-карбоновой кислоты-N- гндроксисукцинимид-эфира из примера 15 перемешивают 2 ч в смеси из 80 мл 0,1М буферного раствора фосфата калия рН 8,5 и 120 мл смеси диоксанди- . метилформамид 1;1. Выпаривают при комнатной температуре до сухого и очищают на силикагеле RP 18 (элюент:градиент от 0,1% трифторуксусной кислоты в воде до 0,1% трифторуксусной кисло- $ ты в изопропаноле - воде 65:35).
Получают 30 мг продукта.
Rf (сшшкагель RP 18, средство те-, кучести: изопропанол - вода 1:1)0,60.
Rf аминодигоксигенина 0,55. 20
Rf резоруфин-Н-гидроксисукцинимид- эфира 0,71.
Пример 21. Получение N-(3- (резоруфин-2 -ил) тфопионил ) -тироксин- метилэфира путем соединения резору- 25 фнн-2-пропионовой кислоты с тироксин- метил эфиром,
а.Гидрирование 7-гидроксикумарина в дигидроксифенилпропионовую кислоту,
6,5 г 7-гидроксикумарина растворя-30 ют в 25 мл 5 М раствора едкого натра, 100 мл воды и 20 мл этанола и после добавления 2 г Pd-активированного угля гидрируют при комнатной температуре и нормальном давлении. Отфильт- ровызают, подкисляют и центрифугируют раствор.
Выход 90%,
НГ-ЯМР (nMCO-de, 2,4-2,9 (га, 4Н); 6,16-6,91 (m, 4H) млн-1.40
б.Резоруфнк-2-пропионовая кислота. 40 ммоль дигидроксифенилпропионовой
кислоты и 40 ммоль нитрозореэорцина растворяют в ДМФ, добавляют 3 г двуокиси марганца и каплями добавляют 5 4 мл серной кислоты. Производное ре- зоруфинз отфильтровывают, растворяют в аммиаке и восстанавливают цинком. Очистку продукта осуществляют хроматографией на силикагеле (растворители: уксусный эфир - метанол 8:1).
Выход 25%.
MS (продукт ТМ S 2, EDM+429.
в.Сопряженная реакция-.
30 мг реэоруфин-2-пропионовой кис-„ лоты превращают с N-гидроксисукцини- кидом и морфолиноэтилизоцианидом в ДМФ Б активный эфир. Затем добавляют 00 мг тяроксинметилэфира и триэтил50
$
0
5
0 с
0
5
0
амина. По окончании реакции подкисляют и очищают через сефадекс 1 Н 20/ЛМФ.
Выход 20 мг.
Пример 22. Получение N-(3-pe- зоруфин-2 -ил-пропионил)-аминоэтил- гидантоина сопряжением резоруфин-2- пропионовой кислоты с аминоэтилгидан- тоином.
Аналогично предшествующей реакции превращения получают соответственно из 150 мг аддукта 100 мг требуемого продукта.
Н-ЯМР (ЛМСО-а6),0: 6,27-7,95 (m, 5H); 7,34 (S, ЮН), .
Пример 23. Получение резору- фин-4-карбоновая кислота(дигоксиге- нинсукциноил)пиперазида путем сопряжения резоруфин-4-карбоновая кислота- пиперазид-трифторацетата с дигоксиге.HHH-CyK4HHOHn-N-rHflpOKCHCyKUHHKMKflOM.
1 ммоль исходных соединений преобразуют, как в примере 1. Получают 170 мг требуемого продукта.
Rf (сшшкагель, растворитель: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 9:1:0,,19.
Пример 24. Получение М-(реэо- руфин-4-карбонил)аминодигоксигеншт- саркозина путем сочетания саркозин- N-оксисукцинимидового эфира резоруфин- 4-карбоновой кислоты с аминодигокси- генином.
0,174 ммоль каждого вещества превращают в требуемый продукт при условии примера 7е.
Rf (силикагель, хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 9:1: :0,1)0,28.
Пример 25. Сопряжение 2-хлор- резоруфин-4-карбоновая кислота-пипе- разид-трифторацетата-с дифенилгиданто- инуксусная кислота-N-гидроксисукцини- мидом.
Превращение осуществляют аналогично примеру 1. Из 270 мг 2-хлор-резору- фин-4-карбоновая кислота-пиперазид- трифторацетата и 173 мг дифенилгидан- тоинилуксусная кислота-N-гидроксисук- цинимид-эфира получают 20 мг Ы-(ди- фенилгидантоинилметилкарбонил)пипора- зид-2-хлоррезоруфин-4-карбоновой кислоты .
Rf (силикагель, растворитель: хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 9:1:0,1)0,380
Пример 26. Получение резору- фин-4-карбонил-тетраиодтироацетил-пиперазида путем сочетания N-оксисукци- нимидового эфира тетраиодуксусной кислоты с пиперазид-трифторацетатом реэо- руфин-4-карбоновой кислоты.
а.Тетрайодотироуксусная кислота- N-гидроксисукцинимид-эфир.
Обычным образом (например, как в примере 21) из кислоты (500 мг) путем превращения с N-гидросукцинимидом и 10 морфолиноэтилизоцианидом получают активный эфир.
Выход 300 мг.
Rf (силикагель, растворитель: хлороформ - метанол - ледяная уксусная 15 кислота 9:1:0,,87.
б.Сопряженная реакция.
0,18 ммоль исходных соединений превращают, как описано в примере 1, в диоксановый буферный раствор с вели- 20 чиной рН 8,5 и очищают через препаратный HPLC. ,
Выход 20 мг. Q
1Н-ЯМР (СД3ОД),0: 7,06, 7,11, 7,80, 7,85 (4S, 4Н); 6,35-7,58 (m, 5H).И
Пример 27. Сопряжение резору- фин-4-карбоновая кислота-пиперазид- трифторацетата с 1-метил-3-(М-сукцин- имидокарбонилпропил)ксантином.
Превращение осуществляют знало- Ю гично примеру 1.
Из 194 мг 1-метил-3-(Ы-сукцинимидо- карбонил)пропилксантина и 245 мг ре- зоруфин-4-карбоновая кислота-пипера- зид-трифторацетата получают 110 мг 35 (1-метил-З-Ы-сукцинимидокарбонилпро- пил)ксантинил-пипераэида резоруфин- 4-карбоновой кислоты.
Rf (силикагель, хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 9:1: ю :0,1)0,43.
Прим ер 28. Определение теофил- лина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.
Опыты проводят так же, как описано 45 в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 7,5 мкг/мл поликлонального антитела по отношению к теофиллину, в качестве раствора резоруфина (3) - раствор JQ 2,14 нмол/л (теофиллин-7-пропионовая кислота)пиперазида реэоруфин-4-карбо- новой кислоты в соответствии с примером 16, а в качестве пробы - человеческую донорскую сыворотку со следую-55 щими добавками теофиллина, мкг/мл: а) 2,5; Ь) 5; с) 10; d) 20 ; е) 40.
В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг. 6.
С помощью этой кривой можно определять концентрацию теофиллина в исследуемых пробах.
Пример 29. Определение тироксина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.
Опыты проводят так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 376 кг/мл поликлонального антитела по отношению к тироксину, в качестве раствора реэоруфина (3) - раствор 1,56 нмол/л (L-тироксин)-пипера- зида резоруфин-4-карбононой кислоты, полученного из соединения в соответствии с примером 3 после отщепления от него с помощью трифторуксусной кислоты защитной ВОС-группы, а в качестве пробы - человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками тироксина, мкг/0,1 л: а)3; Ь) 6; с) 12; d) 18; е) 30.
В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.7. С помощью этой кривой можно определять концентрацию тироксина в исследуемых пробах с неизвестной концентрацией.
Пример 30. Определение дигок- сина в человеческой сыворотке с помощью FPIA.
Опыты проводят так же, как описано в примере 16, но в качестве раствора антитела (2) используют раствор 440 нг/мл поликлонального антитела по отношению к дигоксину, в качестве раствора резоруфина (3) - раствор 0,25 нмол/мл М-(4-резоруфинил-карбо- нил)саркосинил-3-аминодигоксигенина (пример 24). а в качестве проб - человеческую донорскую сыворотку со следующими добавками дигоксина, нг/мл: а) 0,5; Ь) 1; с) 2; d) 3; е) -5.
В результате получают калибровочную кривую, изображенную на фиг.8. С помощью этой кривой можно определять концентрацию дигоксина в исследуемых пробах с неизвестной концентрацией.
В гетерогенном иммуноанализе, прежде чем определить концентрацию свободного или связанного лиганда, необходимо разделение лиганда, связанного с антителом, и свободного лиганда1 посредством осаждения подходящими ществами или посредством применения антитела, связанного с твердым носителем. В гомогенном иммуноанализе исследуют образование комплекса антитело - лиганд в пробе без такого разделения. К методам гомогенного имму- ноанализа могут быть причислены, например, флуоресцентный Qnenching-ме- тод, флуоресцентный Enhancement-метод и флуоресцентный поляризационный метод, при которых флуоресцирующее вещество применяют в качестве метки.
Так как соединения, отвечающие общим формулам 1а или 16, имеют максимумы поглощения и эмиссии, которые в значительной степени лежат вне области биологического материала, мешаю- щего определению вследствие своей собственной флуоресценции, они особенно пригодны для применения в флуоресцентном поляризационном иммуноанализе (ФПИА). Кроме того, предлагаемые сое- динения при подходящем замещении обладают особенно высоким Stokes-пврвмеще нием, достигающим приблизительно 70 нм.
В основном ФПИА-способ базируется на принципе обычного флуоресцентного иммуноанализа„
Если подходящий флуоресцирующий меченый лкганд возбуждается плоско поляризованным светом до флуоресцен- ции, то в результате незначительных временных задержек между возбуждением и эмиссией молекула, прежде чем эмит- тируется излучение9 поворачивается. Таким образом плоскость плоско поляризованного света равным образом поворачивается на определенный угол, Множество молекул внутри этого короткого промежутка времени может привести в результата вращательной диффузии к известной деполяризации флуоресцентной эмиссии. Для поляризации эмиттировакной флуоресценции характерно то, что она тем больше, чем больше молекула, и, следовательно, чем мед- дленнее вращение. Эта зависимость мо жет быть использована для измерения связи лиганда с антителом, так как свободный меченый лиганд имеет меньший объем молекулы, чем комплекс, состоящий из меченого лиганда, связанного с антителом. Поляризация обратно пропорциональна концентрации определяемого лиганда, находящегося в пробе.
Концентрация -меченого лиганда или аналога лиганда и необходимого для такого иммунологического способа антитела определяется в зависимости от
c 0
5
о 0 5 0 5
5
примененного измерительного прибора, а также от характерных свойств примененного меченого лиганда или аналога лиганда и самого антитела. Эта концентрация зависит также от подвергаемого определению лиганда и поэтому должна устанавливаться эмпирически. Это установление может быть произведено посредством простой оптимизации.
Концентрация лиганда, который должен быть определен, в большинстве случаев колеблется в области 10 - моль. Предпочтительная для измерения концентрация лиганда в определяемой пробе составляет 10 - 10 моль, наиболее предпочтительная - 10 - 10 /0моль. Более высокая концентрация лиганда может быть измерена после разбавления первоначальной пробы.
Измерение производят при определенном значении рН, которое может находиться в интервале 3 - 12. Обычно значение рН лежит в области 5 - 10, предпочтительно 6 - 9. Для установления и поддержания определенного значения рН во время измерения могут быть применены различные буферные растворы, например боратный, фосфатный или карбонатный или трис-буфер. При использовании предлагаемых соеди нений не имеет решающего значения то, какой буферный раствор применяют. Выбор определяется, в первую очередь, в зависимости от применяемого антитела, лиганда, который должен быть определен, а также примененной флуоресцентной метки.
Метод ФПИА преимущественно осуществляют при постоянной температуре, обычно при 10 - 40 С.
Точная зависимость между поляризацией и концентрацией подвергаемого определению лиганда или аналога лиганда может быть определена по калибровочной кривой. Ее получают, измеряя значения поляризации растворов с различными, но известными концентрациями соответствующего вещества. Неизвестная концентрация лиганда в исследуемой пробе может быть определена затем по такой калибровочной кривой.
Соединения, отвечающие общим формулам 1а и 1в, могут широко применяться в качестве флуоресцентной метки.
Так, например,в иммунофлуоресцентной микроскопии в качестве антигена белки или целые клетки могут быть сделаны
33
видимыми с помощью флуоресцирующе меченного антитела. В соответствующих способах можно непосредственно наблюдать также распределение гаптена или антигена в клетке в том случае, когда в клетку вводят в качестве флуоресцирующей метки соответствующее соединение, а затем производят наблюдение, например, под микроскопом. При этом, в противоположность описанному выше гомогенному флуоресцентному имму ноанализу, флуоресцентные свойства производных резоруфина не изменяются.
Недостаток известных красителей, которые применяются в качестве флуоресцирующей метки, например таких флуоресцеинов, как флуоресцеинизотио- цианат, или таких родаминовых красителей, как Texas Rot, заключается в том, что они флуоресцируют при относительно малых длинах волн. Кроме того, выход при реакции сочетания с соответствующим носителем чаще всего низок и образующиеся в результате реакции продукты обладают плохой цвето- стабильностью.
Предлагаемые соединения, отвечающие общимформулам 1а и 16, флуоресцируют длинноволново при хорошей цвето- стабильности, причем они с хорошим выходом могут быть получены из соединения, отвечающего общей формуле На или 116, и соответствующего партнера,
применяемого для реакции сочетания.
i.
Предлагаемые соединения могут быть применены для мечения вещества и при других флуоресцентных иммунологических способах. Так, возможно мечение этими реакционноспособными соединениями резоруфина и реагента другой комплек- сообразующей системы. При этом под комплексообразующей системой подразумеваются все те комбинации веществ, которые, учитывая специфическую силу обменного взаимодействия, способны образовывать комплексы. Известными комбинациями являются, например, гормон/спец, рецептор, биотин/авидин, про- изводное углевода/лектин и т.д. Например, меченный биотипом протеин может быть определен с помощью продукта сочетания, полученного из авидина и ре- акционноспособного соединения, отве- чающего общей формуле На или Нб. Кроме того, соединения, отвечающие общим формулам 1а и 16, могут быть применены при определении реагента
162
JQ
15 2025
30
зэ
д« 50,,
181134
системы лектин - производное углевода.
При сортировании клеток в Fluorescent Activateo Cell Sorter применение находят флуоресцирующие частицы латекса. Такие частицы могут быть хорошо флуоресцентно помечены, например, в результате реакции частиц латекса, содержащих гидроксильные группы, аминогруппы или же карбоксильные или сульфокислотные группы, с реакционноспособными соединениями реэо- фурина, отвечающими общим формулам На или 116.
Соединения, отвечающие общим формулам 1а и 16, могут быть применены для определения ферментов. Для этой цели производное резоруфина, отвечающее общей формуле На или Нб, может быть связано с субстратом, который способен расщепляться определяемым ферментом. Этот продукт реакции сочетания также является соединением, отвечающим общей формуле 1а или 16. После взаимодействия меченного резоруфином субстрата, который не вступил во взаимодействие, может быть определена активность фермента. Например, реакционноспособное производное реэоруфина, отвечающее общей формуле На или Нб, может быть связано с гликопептидом, причем полученный в результате этого продукт реакции сочетания может быть применен в качестве субстрата для определения активности эндогликозидазы. Для определения эндогликозидазы известно мечение соединениями данзила. Производные резоруфина в сравнении с такими соединениями отличаются более высокой чувствительностью.
Недостаток известных соединений состоит в том, что длина волны их флуоресцирующего излучения находится в области, где лежит излучение компонентов проб крови, что приводит к искажению результатов измерений. Это следует из кривой 1 на фиг. 9.
Очевидно, что при длине волны 525 нм, соответствующей максимуму флуоресценции известного соединения, сама проба испускает флуоресцирующее излучение, оказывающее мешающее действие. Максимум излучения кспускае-i мого предлагаемым соединением равеа1 по меньшей мере 590 нм. При этой длине волны фоновая флуоресценция пробы крови значительно ниже, чем при
351621811
525 нм (максимум эмиссии известных соединений).
Таким образом, с помощью соединений, полученных по предлагаемому способу, можно без помех, вызываемых компонентами проб, определять содержание лигандов.
Формула изобретения
Способ получения производных резо- руфина общей формулы 1а или 16 ,
1снд,с№4
о
jKCH2)mC(OM.,Lj
де RI - Н или С1 в положении 2} RQ - Н или С -Сдгалкил; R3 - Н, С -Сд-алкил или С1; Кд - Н или RJ и RA вместе образуют аннелированное фенильное кольцо; m 0 или 2; п - 1,
- -СН2-С°°
СН3
ши-Ж V-c-: II О
L 0 сЬязь , С (СНо)/) . 2,
О
где р - 1,2 или 3 ,
-NH-,-NHCH2CH2-,
-ССНоСНоС-,
IIII
оо
1
36
-ССН(ОН)СН(ОН)С-,
оо
А - радикал, образованный из ги- дантоина, дифенилгидантоина, трет-бутилоксикарбонил-Ь-ти- роксина, фенобарбитала, эст- радиола, 7-теофиллина, диго- ксигенина, дигоксигенинмоно- дигитоксозида, З-амино-3- дезокситетраиодотироуксусной кислоты, тироксинметилового эфира или ксантина, причем радикал -(CHg -C-L -Lg-A
при находится в положении 4 и при в положении 2, а в случае и п 0,8...6,4
25
Ч
-НСН9С- ш/ I 2 I
CH О
О
L(j - простая
связь и А - радикал, образо- 30ванный из иммуноглобулина G,
отличающийся тем, что сое- динение общей формулы На или 116
R,
35
I
(
о
СН2)
он 4
50 где Rj-R, m и L( имеют указанные значения;
О
Х4 - Н, С1 или - О -
подвергают взаимодействию с соединением общей формулы III
де L и А имеют
Х - Н или
37t621811
XftLflA, указанные значения;
о-к
О
У
пр ны уд ду
250
i
I
§да150100
:
4t
Ю 15 20 Z5 30 35 Концентрация дифенилшдантоина 6 пробе
Фиг.1
38
причем активные радикалы соединений ( На или 116 и III могут иметь защитные группы, которые при необходимости удаляют, с выделением целевого продукта в свободном виде.
J I I I I I H , I I .....,,, |
5 а я а я x л
юнцентрацив ИифениагиЭатюина Фиг. 2
50
О У/ОЯЯЯЯЯМ Кониснпраци Нифенитидоняючно 8 пробе фие.3
50
Ю J5 20 25 JO Я Концентрация ДФГ б пробе Фиг А
iff
ю а го а я
Конценарщи ДФГ и араОе Фиг.9
9 V IS X 25 30 К «О Кои&мтрощ теофаплина
Фие.6
100-1
11 i-l I I I 11 f i I I I I I I f I I I 11 I 11 I I I I 11 t I I
-g -- g
Стандартный буфер
Фие.7
t г
Коииемтрация Лнвпина Ал
650 6 5600SSO $2S/n500
Фиг.9
Составитель Н.Нарышкова
Корректор М.Демчик
Редактор Л.Веселовская Техред М.Дидык
Заказ 4257ТиражПодписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Корректор М.Демчик
Г 1
| Landon J | |||
| Karael R.S, - Iraraunoas- says, 80 s., Univ | |||
| Park Press, Baltimore Md., 1980, Seite 91-112. |
