Способ определения активности 7- @ -холестерингидроксилазы Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии а именно к биохимии, и может быть ис- пользовано для оценки функционального состояния системы микросомального окисления холестерина в печени путем определения активности фермента 7 -и -холестерингидроксилазы.

Цель изобретения - упрощение способа при одновременном снижении его инвазивности.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Приготовление альбумин-стаби- лизированной эмульсии.

250 мкл 7(п)об-3Н Cholesterol фирмы Amersham с общей радиоактивностью 250 мкКи, растворенного в толуоле, высушивали в токе азота, затем быстро добавляли 0,5 мл ацетона.

Полученный раствор медленно, редкими каплями добавляли при энергичном перемешивании на аппарате типа

Vortex к 17 мл 10%-ного раствора альбумина. Раствор помещали в ток азота до тех пор, пока не исчезал запах ацетона.

Радиоактивность полученной эмульсии определяли, помещая 5 мкл ее в 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8,

Радиоактивность эмульсии составляла 32, имп/мин в расчете на 1 мл эмульсии.

2. Введение радионуклида в кровь

У крыс линии Вистар массой 180- 200 г под легким эфирным наркозом обнажали бедренную вену и вводили в нее 0,4 мл альбумин-стабилизирован- ной эмульсии 3Н-холестерина. Кровотечение останавливали электрокоагуляцией, рану закрывали двумя кож ными швами. Двигательная активность животных полностью восстанавливась в течение 1 ч после введения радионуклида .

3.Сбор мочи для исследования наличия %40.

Использовали способ сбора спонтанно выделенной мочи. Для этого жи- вотных аккуратно извлекали из клеток и помещали на чистую сухую стеклянную поверхность. Через 15-20 с наступало самопроизвольное мочеиспускание. Мочу собирали пастеровской пипеткой в мер- ную пробирку. Процедуру повторяли 3-4 раза через 30-40 мин, добиваясь получения 1-1,5 мл мочи.

4.Перегонка мочи, получение дистиллята.

К 1 мл мочи добавляли 1 мл 20%-ной ТХУ (трихлоруксусная кислота), встряхивали и подвергали дистилляции в микродистилляторе до получения 0,4- 0,6 мл воды.

5.Счет радиоактивности дистиллята .

Радиоактивность полученной три- тиевой воды измеряли на сцентилля- ционном счетчике LS 1 00 фирмы Beckmanj Для этого 0,4-0,6 мл дистиллята помещали в 1 О мл сцинтилляционной жидкости -ЖС-8 и определяли активность счета, имп/мин. Радиоактивность три- тиевой воды рассчитывали на 1 мл

мочи.

Пример 1. Изучали динамику

выведения тритиевой водь с мочой после однократного введения животным (белым крысам) 0,4 мл альбумин-ста- билизированной эмульсии 7(п)оЈ3Н- Cholesterol фирмы Amersham с общей радиоактивностью введенной дозы 6,6- 13 10 ипм./мл мин около 10-15 мкКи на животное. Полученные данные свидетельствуют о том, что уже через 2 и 4 ч после внутривенного введения изотопа в моче появляется и быстро нарастает радиоактивность, обусловленная 3Н20. Максимум ее приходится на вторые сутки после введения меченого холестерина (ЗН-ХС). Затем следует постепенное снижение радиоактивности, отражающее естественную убыль ХС, введенного в организм за счет его гидроксилирования и других метаболических превращений. Динамика выведения тритиевой воды с мочой прослежена до 16 сут, когда радиоактив- ность мочи составляла 27-31% от максимальной, отмеченной на вторые сутки Наиболее динамичные изменения отмечены в первые 5-6 дней после введе

0

0

5

0

ния меченого ХС, т.е. в сроки, когда реализуются большинство экстремальных воздействий на организм. Полученные данные представлены в табл. 1.

Пример 2. Изучали скорость окисления холестерина под влиянием эмоционально-болевого стресса. Динамика выведения с мочой НгО отражает скорость ее образования и, следовательно, активность 7-oi- холесте- рингидроксилазы у контрольных животных (п-8) и крыс, перенесших эмоционально-болевой стресс (п-1 1 ) .

Эмоционально-болевой процесс в виде невроза тревоги воспроизводили по стандартной методике Десидерато (1974). Стрессорное воздействие продолжалось 6 ч. Животных брали в опыт через 1 ч после прекращения стрессового воздействия.

Полученные результаты представлены в табл. 2. i

В табл. 2 показана радиоактивность

дистиллята мочи животных, перенесших эмоционально-болевой стресс (введено 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии Н-холестерина, имп/мин).

Снижение скорости образования Н20 отражает стрессорное ингибирование активности 7-оЈ-гидроксилазы ХС в первые 2 сут после стресса. Затем активность постепенно нормализуется.

Предлагаемый способ определения уровня гидроксилирования ХС в эксперименте ин виво позволяет наблюдать динамику этого процесса у интактных животных и перенесших экстремальное воздействие, а также позволяет оценить защитный эффект химических мем- бранопротекторов и адаптационных способов защиты биологических мембран печени. Способ может быть использован для изучения и прогнозирования процесса атерогенеза.

В сравнении с известным предлагаемый способ обеспечивает упрощение и неинвазивность за счет отсутствия необходимости отбора крови.

формула изобретения

Способ определения активности 7-оЈ-холестерингидроксилазы путем введения экспериментальному животному меченого Н-холестерина с после-; дующим отбором и исследованием биологической жидкости на содержание , отличающийся тем,

514763806

что, с целью упрощения способа приэмульсию Н-холестеряна, которую

одновременном снижении его инвазив-вводят внутривенно однократно, а в

ности, в качестве источника 3Н-холес- качестве биологической жидкости ис

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки функционального состояния системы микросомального (МК) окисления холестерина в печени. Цель изобретения - упрощение способа при снижении его инвазивности. Для этого экспериментальному животному однократно внутривенно вводят стабилизированную эмульсию ³H-холестерина, затем в моче определяют содержание ³H₂O -продукта окисления холестерина под влиянием 7-α-холестерингидроксилазы. Изобретение позволяет оценить функциональное состояние МК в сроки, когда реализуется большинство экстремальных воздействий на организм.

терина используют стабилизированную

Радиоактивность дистиллята мочи контрольных животных после введения 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии 3Н-холестерина (имп/мин)

М+т4,4tO,7 12,7+1,5 22,0+2,2 19,5+1,3 16,8tl,2 13,7+1 13,5+1 13,3+0,6

ТЫСЯЧ НМЛ/МИН

Таблица2

Животное

Радиоактивность, имп/мин Время отбора проб мочи после введения радионуклида

2-4 ч I 24 ч J 42 ч72 ч4 сут5 сут 1 6 сут I 7 сут

1Не отбирали 5125

22941731I

3Не отбирали 13613

4

5

.6

7

S

9

0

1

3145 3145 5551 3905 4232 3905 2614

756i

5974

10333

11231

6814

9609

9929

8063

15797 16222 Не отбирали16897 21896 13733 13420 14386 17097 15542

4680 14661

14915 13836 17694

17747 20267 18714 13938 13739 20302 15012

20222

М+ш 4,j+0,4 8,4+,0,9 16+0,9 17+0,6 16,9+1,1 14,9+0,9 14,3+0,5 11,7+1,1

тысяч

имп/мин

пользуют мочу.

Таблица 1

Не отбирали 15603

То жеНе отбирали

13619

2182515811- 2251120609 - 14420Не отбирали 12771

145521237615250

110291142 16046

166671633813824

Не отбн- 16575. 15037 рали

182201158113192