Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов Советский патент 1989 года по МПК B01D15/08 

Изобретение относится к способу получения полимеризационно-модифи- цированных кремнеземов и может быть использовано для иммобилизации био- специфических лигандов.

Цель изобретения - снижение неспецифической сорбции белков и упрощение способа.

Пример 1. В 5 г сухого ди- метилформамида растворяют 7,1 г ак- риламида (0,1 моль), в 400 мл бензола растворяют 0,318 г лаурилперок- сида и 19,3 г (0,1 моль) п-нитрофе- нилакрилата. Растворы при перемешивании смешивают. Затем к этому раствору добавляют 1,3 мл ТГМ-3 (5% от массы мономеров). Приготовленную смесь помещают в предварительно загруженный 180 г макропористого стекла с диаметром пор 2300 X и удельной поверхностью 28 м /г реактор объемом 0,01 м3. Реакционную смесь перемешивают в течение1 5 мин. Вакуумируют раствор и нагревают реакционную смесь до 70 V. R течение 3 ч проводят модификаппм кремнезема сополимером. По окончили прививки кремнезем промни.кп горячим диметилформамидом, гЬосчЪ,чии--м буфером рН 4,5, этанолом, ч Ьцр. м и сушат

4 1 J

-U

СО Ј

на лиофильнои гушке. Последующая обработка модифицированного кррмнезе- ма 25%-нмм раствором водного аммиака дает содержание 40 мкмоль п-нит- рофенилакрилатных групп на 1 г тпер- дой фазы. Ход реакции контролируют спектрофотометрически при ЯМакс 405 нм, фиксируя количество вьще- ляюпегося нитрофенола.

II р и м е р 2. Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г п-нитрофеннлакрилата (0,1 моль) берут 21,3 г акриламида (0,3 моль), а лаурилпероксид берут в количестве 0,8 г, содержанье п-нитрофенилакри- латных групп составляет 20 мкмоль на 1 г твердой фазы.

Пример 3. Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г ,п-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут 2,4 г (0,033 моль) акриламида, а ТГМ-3 добавляют в количестве 2,2 г (10% от массы мономеров). Содержание n-нитрофенилакрилатных групп состав- ляет 60 мкмоль на 1 г твердой фазы.

П р и м е р 4. Синтез носителя проводя по примеру 1, но на 19,3 г п-нитро- фенилакрилата (0,1 моль) берут 35 9 5 г акриламида. Содержание n-нит рофенилакрилатных групп составляет 2 мкмоль на 1 г твердой фазы.

П р и м е р 5. Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г

п-нитрофенилакрилата (0,1 моль) бе

рут 1,4 г акриламида. Содержание п- нитрофенилакрилатных групп составляет 10 мкмоль на 1 г твердой фазы.

П р и м е р 6. Синтез матрицы проводят по примеру 1, но берут 3,5 г акриламида и 19,6 г п-нитрофенилакрилата а вместо 1 мл ТГМ-3 добавляют 1 мл ТГМ-13. Содержание n-нитрофенилакрилатных групп составляет 80 мкмоль на 1 г твердой фазы.

Пример 7. Модификация кремнезема сополимером акриламида и п- нитрофенилакрилата с соотношением сомономеров 3:1.

Синтез проводят по примеру 2, но ТГМ-3 добавляют в количестве 6 г (15% от массы мономеров). Содержание n-нитрофенилакрилатных групп составляет 30 мкмоль на 1 г твердой фазы.

П р и м е р 8. Для блокирования активированных групп и последующего определения неспецифической сорбции белков 1 г носителя, полученного по предлагаемому способу, прибавляют

Q

5

и 10 мл 5%-нот о раствора зтанолами- на в диметилформамиде и перемешивают при встряхивании 24 ч. Раствор этаноламина декантируют, инактивиро- ванный НОСНТР.ЛЬ промывают 3 раза по 50 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего О, М NaCl и помещают в колонку размером см. Неспецифическую сорбцию Ј -химотрип- сина и альбумина определяют в указанном буфере при нанесении 3 мг белка в 0,3 мл буфера. Злюируют со скоростью 0,5 мл/мин. Сорбцию хрома-С определяют в условиях известного способа: 0,02 М фосфатный буфер, рН 9,0. Колонка см, проба белка 1 мг в 0,1 мл буфера. Содержание бед- ка в элюате определяют по Кумасси, Б таблице представлены сравнительные результаты.

Прим е р 9. Определение емкости активированного носителя по иммуноглобулину G. К 1 мл 10%-ного раствора иммуноглобулина G человека прибавляют 4 мл бикарбонатного буфера (0,3 М раствора NaHTOj, содержащего 0,1 М NaCl), К полученному раствору прибавляют 1 г активированного носителя, встряхивают и инкубируют 24 ч при 4°С. Затем носитель промывают на пористом фильтре 50 мл бикарбонатного буфера, фильтрат диализуют против того же буфера, после чего измеряют его объем и оптическую плотность при А 280 нм (D,). 1 мл 10%- ного раствора иммуноглобулина разбавляют бикарбонатным буфером до объема фильтрата и измеряют оптическую плотность при Л 280 нм (Пд). Емкость активированного носителя рассчитывают по формуле

с VL . юо

D

тг

5

Величины неспецифической сорбции белков на носителях по примерам 1-7 и емкость носителей по иммуноглобулину G представлены в таблице.

Носитель, полученный по предлагаемому способу, позволяет иммобилизовать значительные количества белка (до 65 мг/г носителя), обладает при этом низкой неспецифической адсорбцией белков (0,2-0,3 мг/г носителя) и может служить исходной основой для получения большого количества афин- ных сорбентов. Кроме того, носитель обладает всеми преимуществами тверsK

докаркасиь х хроматографических материалов - высокой механической прочностью, ненабухаемостью в органических растворителях, устойчивостью к действию микроорганизмов и, следовательно, может быть использован в массивных колонках с высоким давлением и высокой скоростью потока элю- ента.

396

при их молярном соотношении (1-3): :(3-1) в присутствии сшивающего агента - диметакрилата олигозтиленгли- коля, а в качестве инициатора поли- меризации используют лаурилпероксид.

Изобретение относится к способам получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов и позволяет снизить неспецифическую сорбцию белков и упростить способ. Макропористый кремнезем с диаметром пор 50-230 нм смачивают 3-10%-ным раствором сомономеров в органическом растворителе (6-22% от массы кремнезема), при этом сомономеры - N -нитрофенилакрилат и акриламид- берут в мольном отношении от 1:3 до 3:1. В смесь добавляют диметакрилат олигоэтиленгликоля (ТГМ-3, ТГМ-13) в количестве 5-10% от массы мономеров и лаурилпероксид в количестве 0,5-2% от массы мономеров. Реакционную смесь перемешивают, вакуумируют, нагревают до 70°с и выдерживают 3 ч. Продукт промывают диметилформамидом, этанолом и высушивают. 1 табл.

Формула изобретения

Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммоби- лизации биоспецифических лигандов, включающий обработку макропористого кремнеземного носителя раствором со- мономеров n-нитрофенилакрилата и амида акриловой кислоты с последую- щей полимеризацией сомономеров в присутствии инициатора, отличающийся тем, что, с целью снижения неспецифической сорбции белков и упрощения способа, кремнезем

обрабатывают раствором сомономеров

Редактор Н.Тупица

Составитель Т.Чиликина Техред М.Дидык

Заказ 2188/10

Тираж 600

ВНИШШ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Корректор Э.Лончакова

Подписное