Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений Советский патент 1980 года по МПК A61K38/43 

ции с последующей сшивкой глутаровым альдегидом. К полученным аминированным носителям ковалентно присоединяют полиакриловую кислоту (ПАК), используя водорастворимый карбодимид 2 . Однако псшучение водонераствориких биологически активных соединений этим способом имеет ряд недостатков. После иммобилизации веществ на таких носителях остаются остаточные амино группы, обуславливаю дие неспецифическую адсорбцию кислых белков и нуклеиновых кислот. Это явление крайне нежелательное, особенно при иммобилизации соединений для биоспецифической хроматографии. Получение иммобилизованных препаратов этим способом, как правило, многостадийно. Функциональное разнообразие получаемых носителей также ограничено.

Целью предлагаемого способа является улучшение качества целевых продуктов и упрощение способа их получения. Указанная цель достигается за счет того, что кремнеземную основу при 55-б5с подвергают действию ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давле- НИИ 35-400 мм Нд с последующей, в случае необходимости, активацией привитых полимеров для образования реакционноспособных групп и взаимо SiO j-CH CH-CHjCH-...(Щ -СН-СН-СН,СН

СООН CONHfCH l NH-©

- действем полученных носителей с растворами биологически активных соединений обычно при Q-20 C в течение 2-20 ч.

Согласно изобретению способ полуt чения водонёрастворимых биологически активных соединений с улучшенным качеством целевых продуктов заключается в том, что кремнеземную основу модифицируют гидрофильными

органическими полимерами. Модификация достигается за счет того, что

носитель подвергают при SS-eS C обычно в течение 2-10 ч действию ионизирукнцего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Нд. Полученный модифицированный носитель, в случае необходимости дополнительно активируют известными приемами, обычно путем обработки бифункциональными реагентами, в качестве которых используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды, и полученный носитель подвергают взаимодействию с растворами биологически активных соединений. В качестве биологически активных соединений обычно используют ферменты, лиганды, нуклеотиды.

Получаемые водонерастворимые биологически активные вещества содержат звенья следующей структуры:

I СООН CO-(L

SiOJ-CH,CH-CH,CH. гу ,г,

СНгО-(Г где L - иммобилизованное соединение липид, фермент, нуклеЬтид и т.д. Улучшение качества иммобилизованных биологически активных соединений достигается, во-первых, за счет увеличения емкости. Концентрация функционсшьных групп для иммобилизации достигает 4 ммолей на грамм, носителя что в 8 раз превосходит концентрацию функциЬнальных групп на обычных кремнеземных носителях. Повышение емкости не так существенно при иммобилизации белков, но очень важно 1при иммобилизации низкомолекулярных лигандов (нуклеитидов, аминокислот и др.) для аффинной хроматографии. Улучшение качества иммобилизованных биологически активных соединений достигается также отсутствием в полу ченных препаратах неспецифически сор бированных белков и нуклеиновых ки.слот. Неспецифическая сорбция сывороSfO,)-CH,CH-CH,CH II

(L.

онОС точного альбумина при рН 7,4 на таких носителях в 5 раз меньше, чем для исходного макропористого кремнезема и в 10-20 раз меньше, чем у кремнеземных носителей, получаемых через аминопропилпроизводное или через ПЭИ. Низкая неспецифическая сорбция на получаемых сорбентах объясняется понижением свободной энергии поверхности в следствие сглаживания внутренней .поверхности привитыми органическими полимерами. Положительный эффект описываемого способа состоит в том, что: 1. Способ дает высокий выход иммобилизованного продукта (особенно для ннзкомолекулярных лигандов), так как концентрация активных групп на носителе достигает 2-4 ммолей на грамм. Например, при иммобилизации уриднн 5-монофосфата фосфодиэфирным методом количество иммобилизованного нуклеотида достигает 20 мг на мл сорбента, тогда как на органических носителях типа сефароэы эта величина почти на порядок ниже. 2.Использование для иммобилизаци кремнеземных носителей с привитой по акриловой кислотой снижает неспецифи ческую сорбцию кислых белков и нукле иновых кислот. Неспецифическая сорбция бычьего сывороточного альбумина в 0,1 м фосфатном буфере рН 7,4 на т ких носителях в 5 раз меньше, чем у исходного макропористого кремнезема и в 10-20 раз меньше, чем у кремнеземных носителях, получемых через аминопропилпроизводное. Неспецифическая сорбция денатурированных-фрах ментов ДНК (длиной 500 пар нуклеотидов) при рН 6,0 на таких носителях в 10-15 раз меньше, чем на кремнеземных носителях непокрытых полимерами и не превышает 2-3 оптических единиц при Л 260 нм. 3. Данный способ дает возможность И Лмобилизовать биологически активные соединения на органонеорганичес ких носителях, содержащих практичес ки любые отнотипные (в зависимости от взятого мономера) группы. Например, при полимеризации акриловой кислоты получают карбоксильные груп пы, при полимеризации винилацетата после омыления получают вторичные спиртовые группы) при полимеризации зтиленгликоль метакрилата получают первичные спиртовые группы и т.д. Нижеследующие примеры служат иллюстрацией описываемого способа. Пример 1. Макропористый жремнезем - силохром (30 г) поме11аю в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давления 10 мм Нд при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают Со° в течение 2-х ч при мощности дозы 40-50 рад/с в при сутствии паров акриловой кислоты. Процесс проводят при 60-65-с и при давлении паров акриловой кислоты 35-40 мм Нд. Полученный носитель отмывают кипящим метанолом до постоянного веса. Получают производное 1 с содержанием углерода до 15% и с концентрацией карбоксильных гру до 3 молей на грамм носителя. К производному 1 в 500 мл сухого хлор форма добавляют 9 мл хлористого тио нила, 0,5 мл диметилформамида и кип тят реакционную массу 2 ч при перемешивании. Продукт промывают на фил ре сухим хлороформом, суспензируют в 500 мл сухого хлороформа, добавляют 300 мл этилендиамина, 18 мл тр этиламина и кипятят 3 ч при перемешивании. Полученный носитель тщательно промывают на фильтре хлорофо мом, ацетоном, водой, ацетоном. Отб рают 2 г полученного сорбента и сус пендируют в 10 мл хлористого метиле на, содержащего 50 мг модифицированного фосфатидилхолина (при С,; находятся карбоксильнная группа, активированная N-оксисукцинимидом). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре 20 ч. По окончании реакции сорбент промывают хлороформом, метанолом и высушивают. Количество связанного лиганда составляет -V 17 мг на 1 г носителя. Полученный биспецифический сорбент опробован для выделения липидпереносящегося белка (ЛПБ). Сорбент оказался весьма эффективным. На нем была достигнута степень селективности, равная 3,0 (отношение количества адсорбированного ЛПБ в процентах к общему количеству адсорбированного белка в процентах) и высокая степень очистки, равная 20 (отношение удельной активности ЛПБ после десорбции с носителя и удельной активности ЛПБ в исходной белковой фракции). Попытка выделить ЛПБ на том же -лиганде, но присоединенном к аминопропилсилоxpONiy, была неудачной. В этом случае степень селективности составляла 1,8, а степень очистки только 1,3. П р и м е р 2. Носитель 1 (см.пр.1) суспендируют в 5 мл воды, добавляют 200 мг 1-циклогексил-З-( 2-морфолиноэтилкарбодиимида мето-р-толуолсульфоната)(водорастворимого карбодиимида), поддерживают рН 4,5-6,0 и прибавляют 100 мг панкреатической рибонуклеазы. Реакционную смесь перемешивают на качалке при 0-5°С в течение 4 ч. Водонерастворимый продукт отмывают на фильтре 1 MNaCl и водой до отсутствия .детектируемых количеств белка в промывках. Водонерастворимый продукт содержит 40 мг белка на грамм носителя. Иммобилизованный препарат использован для .обработки белковых дрожжевых экстрактов с целью расщепления содержащихся там нуклеиновых кислот до коротких олигонуклеотидов. Один грамм иммобилизованного препарата эффективно гидролизуют нуклеиновые кислоты (до содержания кислоторастворимой доли 80-90%), содержащиеся в 50 г дрожжевой биомассы. В течение 10 циклов работы активность иммобилизованного фермента снижается на 20-25%. Пример 3. Производное 1 (4 г), полученное на основе пористого стекла (см,пр.1), суспендируют в 100 МП абсолютного метанола, насыщенного НС1, и кипятят 2 ч. Промывают метанолом (500 мл), суспендируют в 100 МП абсолютного ТГФ, содержащего 1 г LiAlH и кипятят при перемешивании 8 ч. Полученный носитель промывают ТГФ (200 мл) эфиром (200 мп) и высушивают на фильтре ацетоном. Полученный носитель (2 г ) суспендируют в 10 мл воды при рН 5,5-6,0, добавляют 800 мг водорастворимого карбодиимида и 200 мг уридин 5-монофосфата. Перемешивают 4 ч и отмывают на фильтре l.MNaCl и водой до отсутствия поглоще ния при v 260 им. Водонерастворимый продукт содержит до 50 мг нуклеотида на грамм носителя 20 мг/мл носителя и стабилен при комнатной температуре в высушенном состоянии. Пример 4. Силикагель (30 г) помещают в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давления мм Нд при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают на установке ТРЦ-ЗА рентгеновскими лучами в течение 10 ч с мощностью дозы 90-100 рад/с в присутствии паров винилацетата при 55бО и при давлении паров 350-400 ммНд К полученному носителю (10 г) в 50 мл сухого метанола добавляют раствор ме тилата натрия, приготовленный растворением 0,6 г металлического натрия в 9,4 мл сухого метанола, и кипятят при перемешивании.1 ч. Затем промывают на фильтре метанолом, высушиваю 200 мл абсолютного хл суспендируют в содержащего 15 г п-нитробен роформа зоилхлорида и 5 мл триэтиламина, и кипятят 2 ч при перемешивании. Промы вают на фильтре хлороформом, ацетоном, водой, ацетоном. Подученный носитель суспендируют в 100 мл воды, содержащей 10 мл пиридина, добавляют 10 г N325/2.0 и кипятят 1 час. Промывают на фильтре водой и суспендируют пол учтенный носитель (2 г) в 50 мл 2,5 н HCI. Реакционную массу охлаждают до , добавляют 840 мг NanOj и перемешивают при +5С на холоде в течение 30 мин. Промывают на фильтре водой, 0,1 М фосфатным буфером рН 8,0 и суспендируют в 5 мл тог же буфера, содержащего фермент экзонуклеазу А5 (1 мг/мл). Инкубируют 2 ч при 0-5°С, затем промывают на фильтре 1 М NaCl и водой до отсутствия белка в Промывках. Иммобилизованный препарат обладает активностью до 1000 ед.акт. на 1 г препарата (2 мг белка на 1 грамм препарата). Одного грамма- иммобилизованного пре-. парата достаточно для превращения 0,5 г РНК за 18 ч в гидролизат, содержащий 60-70% нуклеозид 5-монофосфатов. В течение 10 циклов работы активность иммобилизованного фермента снижается на 25-30%. Формула изобретения 1.Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений, включающий модификацию кремнеземной основы путем покрытия гидрофильными органическими полимерами, последующую, в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества.целевого продукта, кремнеземную основу модифицируют при 55- 65с действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Нд. 2.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, липиды, нуклеотиды. 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что активацию моди,фицированного носителя осуществляют бифункциональными реагентами. 4.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве дифункционального реагентов используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР №455741, кл. В 01 J 11/00, 1975. 2.G . Р .- Roye г , G .М . Green , B.K.Sinha Rigid Support materials for the immobilization of enzymes, J. Macromol. Sei., Chem, A 10, 1-2, 289-307, 1976 (прототип).