Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией Советский патент 1989 года по МПК G01N30/48 B01J20/10 

1

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии при умеренном давлении, в частности к получению химически модифицированных кремнеземных сорбентов для ВЭЖХ, и может быть использовано для определения низкомолекулярных гидрофобных примесей (например, лекарств) в биологических жидкостях.

Целью изобретения является повышение разделительной способности сорбента по лекарственным препаратам и их метаболитам.

Пример 1. Юг силикагеля Силасорб Si-ЗОО (ЧССР) со средним диаметром пор 10 нм и частицами размером 15 мкм с гидроксшшрованной поверхностью помещают в 0,1 М натрий-ацетатный буферный раствор (рН 5,65) и нагревают на водяной бане до 95 С при медленном перемешивании механической

мешалкой. Суспензию заливают 15 мл перегнанного -j-глицидоксипропилтри- этоксисилана и перемешивают смесь при той же температуре 1 ч. Затем продукт отмывают на стеклянном фильтре водой и кипятят при перемешивании 1 ч в 0,01 М соляной кислоте для образования диольных групп вместо исходных эпоксидных. Полученный диольный сорбент отмывают водой до нейтрального рН, промывают ацетоном, эфиром и 200 мл абсолютного диоксана. Помещают сорбент в реакционный сосуд, снабженный мешалкой.

10 г предварительно очищенного и высушенного п-толуолсульфо-хлорида растворяют в 10 мл абсолютного диоксана и, добавив 15 мл абсолютного пиридина, заливают в реакционный сосуд с промытым в диоксаке сорбентом. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре,

Јь

|

00

ю

осторожно перемешивая. Полученную активированную гликофазу промывают на стеклянном фильтре 350 мл лиоксана для удаления непрореагировавших остатков реакционной смеси, сушат и про мывают карбонатным буферным раствором (0,15 К, рН 8,5).

0,6 г глицин-Ь-лейцика растворяют в 10 мл того же буферного раствора и добавляют туда активированную гликофазу. Выдерживают при осторожном перемешивании и при комнатной температуре 2ч, после пего модифицированный кремнезем отмывают на стеклянном фильтре от непрореагировавшего дипеп- тида и обрабатывают 1 М трис-HCl буферным раствором (рН 8,8) в течение 1 0,5 гидрохлорида цистеина растворяют в 10 мл дистиллированной-воды и доводят рН до 5,3 0,1 М КОН. Помещают в приготовленный раствор тщательно отмытый водой модифицированный кремнезем и снова доводят рН до 5,3. Прибавляют 5 мл раствора, содержащего 0,5 г папаина, и выдерживают при перемешивании 1,5 ч при комнатной температуре. Полученный таким образом сорбент промывают на стеклянном фильтре водой, 300 мл этанола и су- шат.

П р и м е р 2. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют сили- кагель КСК-2 с размером частиц 15 мкм.

II р и м е р 3. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том,что в качестве исходного кремнезема используют силика- гель Силасорб Si-600 с размером частиц 10 мкм.

На фиг. 1 (А и Б) и 2 приведены хроматограммы биологических жидкостей на образцах сорбента, полученного предлагаемым способом.

На фиг.1Л показано хроматографи- ческое разделение антиконвульсантов в человеческой плазме при прямом вводе на колонку с Силасорбом Si-600 (размер частиц 10 мкм), обработанным по предлагаемому способу, размер ко- шонки 50 х 5.мм: 1 - белки человеческой плазмы, 2 - фенобарбитал, 3 - карбамазепин, 4 - фенитоин; на фиг. 1Б - хроматографическое выделение фенобарбитала из человеческой слюны при прямом вводе на колонку с Силасорбом Si-ЗОО (размер частиц

0

5

.

0

5

0

5

0

5

0

5

15 мкм), обработанным по предлагаемому способу: 1 - белки человеческой слюны, 2 - фенобарбитал. Подвижная фаза - 0,01 М трис-(гидроксиметил)- аминометан + 0,2 М фосфатный буферный раствор (рК 7,10), расход 1 мл/ /мин, детектор - УФ (254 нм), объем образца 2Ь мкл.

На фиг. 2 показано хроматографическое выделение тилозина из культу- ральной жидкости его продуцента (образец отфильтрован от взвесей) при прямом вводе на колонку с КСК-2, обработанным по предлагаемому способу, размер колонки 50x5 мм: 1 - белки из культуральной жидкости, 2 - тилозин, 3 - подвижная фаза - вода 25% + этанол 75%, расход 0,5 мл/мин, детектор - УФ (280 нм), объем образца 25 мкл.

П р и м е р 4. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но у-глицидоксипропилтриэтоксисилан добавляют в холодный ацетатный буферный раствор с рН 5,4, затем туда помещают силикагель и нагревают на водяной бане при перемешивании.

Хроматографические характеристики сорбента соответствуют хроматографи- ческим характеристикам сорбента по примеру 1.

Ир и м е р 5. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но вместо абсолютированного диоксана используют абсолютированный тетрагидро- фуран, а вместо пиридина - триметил- амин.

Характеристики сорбента аналогичны хроматографическим характеристикам сорбента, полученного по примеру 1.

П р и м е р 6. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, но вместо гидрохлорида цистеина используют раствор 2-меркаптоэтанола в ацетатном буферном растворе.

Характеристики сорбента аналогичны характеристикам сорбента по примеру 1 .

В таблице даны сравнительные характеристики сорбентов по известному и предлагаемому способам.

При использовании сорбента по предлагаемому способу наблюдается полное разделение лекарственных препаратов (фенобарбитал, фенитоин, карбамазепин) при анализе образцов плазмы. При этом за счет повышении разделительной способности сорбента, полученного по предлагаемому способу, удается приме нить более крупные частицы для запол

514

нения колонки и значительно сократить длину колонки, что приводит к снижению давления на входе в систему и к возможности использования относительно простого оборудования для жидкостной хроматографии при умеренном (до 50 бар) давлении. Кроме того, при применении частиц большого диаметра и стеклянных колонок применим сухой способ набивки колонок, также снижающий стоимость изготовления и применения полученного сорбента.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией, включающий

12&

последовательную обработку кремнезема с диаметром пор 6-10 нм растворами т глицндокснпропилтриэтокс.нсилана, органического активирующего вещества, пептида и фермента, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью повышения разделительной способности сорбента по лекарственным препаратам и их метаболитам, обработку у-глнцидо- ксипропилтриэтоксисиланом проводят в водном буферном растворе, в качестве активирующего вещества используют п-толуолсульфохлорид в абсолютированном растворителе в присутствии органического основания, в качестве пептида используют глицик-Ь-лейцин, а в качестве фермента - папаин.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине ,в частности, к синтезу сорбентов для анализа низкомолекулярных гидрофобных соединений в биологических жидкостях методом жидкостной хроматографии. Целью изобретения является повышение разделительной способности сорбента и упрощение его получения и использования. Способ модифицирования исходного кремнеземного носителя заключается в последовательной обработке кремнезема γ-глицидоксипропилтриэтоксисиланом в водном растворе, п-толуолсульфохлоридом в диоксане, дипептидом формулы глицин-L-лейцин и окончательной обработке папаином для гидролиза доступных пептидных связей. 1 табл., 2 ил.

Образец

Привитый пептид

Размер частиц, мкм Колонка, мм Давление, бар Расход ПФ, мл/мин Время, мин Объем пробы, мкл Детектор

Нефильтрованная плазма пациентов

Глицик-L-лейцин

О 2 Ч 6 8 10

время, мин Физ.1

Составитель Т.Чиликина Редактор С.Пекарь Техред Л.Олийнык Корректор С.Черни

Заказ 2356/43

Тираж 790

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина,101

Ц 8 12 16 время, мин

Фиг.2.

Подписное