Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к реассортанту вируса гриппа Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/42 

Изобретение относится к гидридом- ной технологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (мон AT) к вирусу гриппа.

Аналогов в патентной и научно-технической литературе не выявлено.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример. 10 мышей линии BALB/c трехкратно иммунизируют очищенным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы концентратом реассортанта вируса гриппа А (Ленинград) 385(80)К. Первые две иммунизации проводят внутрибрюшинно с месячным интервалом, используя в каждом цикле иммунизации 10000 ГАЕ вируса на мышь. Через две недели мышей иммунизируют j внутривенно той же дозой вируса. Че рез 4 дня после этого мышей забивают,

отбирают в асептических условиях селезенки, которые гомогенизируют в питательной среде RPM1 1640 из расчета 5 мл среды на одну селезенку. Гомоге- низат центрифугируют в течение 7 мин при 1000 об/мин. Осадок отделяют декантированием надосадочной жидкости.

Клетки мышиной миеломы линии NS-0 культивируют 2 недели в питательной среде RPM1 1640, дополнительно содержащей 15 об.% сыворотки эмбрионов коров и 4,5 г/л глюкозы. За день до влияния миеломные клетки пересевают с коэффициентом 1:2 в матрицы с вышеуказанной средой. Культивирование миеломных клеток осуществляют при 37 С.

Непосредственно перед слиянием миеломные клетки снимают с матрацев встряхиванием и центрифугируют в указанном режиме. Осадок, содержащий

миеломные клетки, используют в последующей операции.

Селезеночные и миеломные клетки смешивают в соотношении 8:1, отмывают средой RPM.1,1640, центрифугируют в том же режиме и добавляют к осадку 50%-ный раствор ПЭГ в той же среде, рН 8,0. Операцию слияния проводят в

дя при этом отбор позитивных клонов. Тестирование проводят в РТГА с 1%- ной взвесью эритроцитов кур, а также в иммуноферментном анализе (ИФА). О наличии позитивных клонов судят по факту торможения гемагглютинации в РТГА и/или положительному ответу в ИФА. Эти клоны отбирают и размножают

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения гибридомы, продуцирующей мон АТ к реассортанту вируса гриппа. Способ заключается в том, что мышей иммунизируют концентратом соответствующего реассоранта вируса гриппа и извлекают селезенки. Параллельно получают клетки мышиной миеломы, сливают клетки селезенки и миеломы в соотношении 8:1 в присутствии полиэтиленгликоля мол. м. 6000. Полученные гибридные клетки выращивают в селективной питательной среде на фидерном слое тимуса сингенных мышей. Через 6-8 дней культивирование ведут в условиях лимитации аминоптерина, а после отмирания родительских миеломных клеток - лимитации гипоксантина и тимидина. 1 табл.

течение 15 мин при 37 С в водяной ба- JQ в матрацах, заполненных 15 мл пита- не. При этом через 1 мин после добавления ПЭГа (из расчета 1 мл раствора последнего на одну селезенку) клеточную взвесь разбавляют по каплям указанной питательной средой из расчета 15 10 мл на одну селезенку.

Далее смесь центрифугируют при том же режиме. К полученному осадку добавляют среду RPM1 1640, содержащую 20 об.% сыворотки эмбрионов ко- 20 ров, 4,5 г/л глюкозы, а также HAT. При HAT

раствора гипоксантина, 1 мл 4 х х водного раствора аминоптери-25 на и 1 мл 1, Н водного раствора тимидина на 100 мл среды. Количество среды с указанными добавками берут

этом концентрация компонентов составляет 1 мл водного

тельной среды RPM1 1640, дополнительно содержащей 20 об.% сыворотки эмбрионов коров и 4,5 г/л глюкозы. Получают целевой продукт - гибридомы продуцирующие мои AT к использованному реассортанту вируса гриппа с обратным титром в РТГА 16-32, а в ИФА - 1000-2000 (см. таблицу).

В таблице представлены результаты тестирования в РТГА трех моноклонов, полученных гибридом с вариантами H3N2 и H1N1 вирусов гриппа типа А.

Как видно из таблицы, монокло- нальные антитела, продуцируемые гиб- ридомами 1 и 3 клонов, 1 и 3 обладают более узкой специфичностью, чем при использовании клона 2.

из расчета посевной дозы гибридом

10 клеток на 1 лунку.

Полученной взвесью гибридных клеток заполняют лунки трех 96-луночных планшетов (по 0,2- мл в лунку). За 1 день до операции слияния в названные лунки вносят по 10 клеток тимуса сингенных мышей.

Планшеты помещают в инкубатор при , 80%-ной относительной влажности и содержании С04 в воздухе 5%.

Через 7 дней инкубирования из селективной среды исключают аминопте- рин. Для этого находящуюся над слоем клеток среду отсасывают и замещают на среду RPM1 1640, содержащую сыворотку эмбрионов коров, глюкозу, гипо

сантин и тимидин в указанных концентрациях.

Еще через 7 дней находящуюся над слоем клеток среду вторично отсасывают и замещают на среду RPM1 1640, содержащую сыворотку эмбрионов и глюкозу в указанных концентрациях, исключая тем самым гипоксантин и тимидин. В этой среде культивирование продолжают в течение 2 мес.

По мере образования клонов гибридом, занимающих не менее 1/4 поверхности лунки, часть культуральной жидкости отбирают и тестируют, произвоQ в матрацах, заполненных 15 мл пита- 5

0

5

5

0

0

5

0

5

тельной среды RPM1 1640, дополнительно содержащей 20 об.% сыворотки эмбрионов коров и 4,5 г/л глюкозы. Получают целевой продукт - гибридомы, продуцирующие мои AT к использованному реассортанту вируса гриппа с обратным титром в РТГА 16-32, а в ИФА - 1000-2000 (см. таблицу).

В таблице представлены результаты тестирования в РТГА трех моноклонов, полученных гибридом с вариантами H3N2 и H1N1 вирусов гриппа типа А.

Как видно из таблицы, монокло- нальные антитела, продуцируемые гиб- ридомами 1 и 3 клонов, 1 и 3 обладают более узкой специфичностью, чем при использовании клона 2.

Полученные мои AT высокоспецифичны в отношении вирусов гриппа, относящихся к серотипу H3N2.

Характеристика полученных и испытанных гибридом гибридома клона 1. Наименование клона гибридомы XI, вид гибридоны В-клеточная, родительские клетки гибридомы: злокачественный партнер - NS-0/1, нормальный партнер - спленоциты мыши BALB/c, иммунной к вирусу гриппа А(Ленинград/ /385)80 (H3N2)R.

Специфическая активность гидридо- мы. Специфически активна к гемагглю- тинину вируса гриппа А(Ленинград/ /3S5)80 (H3N2)R в РТГА и ИФА.

Синтез антител (их специфичность). Значение титров антител: 1:32 в РТГА и 1:2000 в ИФА - в культуральной

жидкости, 1:640 - 1:1280 в РТГА - в асцитной жидкости. Класс иммуноглобулинов G.

При культивировании в организме мышей образует твердые и асцитные формы опухолей. Образование асцитов на 14-18 день.

Гибридома клона 2. Наименование клона гибридомы Х2. Вид гибридомы В- клеточная. Родительские клетки гибридомы: злокачественный партнер - NS-0/1, нормальный партнер - спленоциты мыши BALB/c иммунной к вирусу гриппа А(Ленинград/385)80 (H3N2)R.

Специфическая активность гибридо- мы. Специфически активна к гемагглю --- тинину вируса гриппа А(Ленинград/ /385)80 (H3N2)R в РТГА и ИФА.

Синтез антител (их специфичность). Значение титров антител 1:32 в РТГА и 1:2000 в ИФА - в культуральной жидкости, 1:640 - в РТГА в асцитной жидкости. Класс иммуноглобулинов G.

При культивировании в организме мышей образует твердые и асцитные формы опухолей. Образование асцитов на 14-18 день.

Использование способа позволяет . получать мои AT к реассортанту вируса гриппа.

Тест-вирусы

А(Бангкок/1)79 (H3N2)160320640

А(Техас/1)77 (H3N2)2016080

А(Филиппины/2)83 (H3N2)808040

А(Бангкок/2)79 (H3N2)80 4080

А(Ленинград/385)80R (II3N2)160320640

А(Прага/1)84 (Н1Н1) 2080 20

А(Киев/53)79 (H1N1) 208080

А(Хабаровск/74)77 (H1N1) 2080 20

Составитель Г.Смирнова Редактор М.Недолуженко Техред М.Дидык Корректор С.Шекмар

Заказ 2785/21

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Формула изобретения

Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к реассортанту вируса гриппа, заключающийся в том, что клетки селезенки мышей, иммунизированных концентратом реассортанта вируса гриппа, сливают

с клетками мышиной миеломы при соотношении клеток 8:1 соответственно в присутствии полиэтиленгликоля мол.м. 6000 и гибридные клетки выращивают в селективной среде на фидерном слое

5 тимуса сингенных мышей в условиях лимитации аминоптерина через 6-8 дней выращивания, а гипоксантина и тими- дина после отмирания родительских миеломных клеток.

РТГА с 4 ГАЕ вирусов при разведении асцитической жидкости в клоне

1

IZIZ1

Подписное