Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к медицинской вирусологии.
, Цель изобретения - получение гиб- ридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину - поверхностному гликопротеину вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (H3N2).
Полученный штамм гибридных клеток обозначен АН-РСК-4Н8.
Штамм хранится в коллекции клеточных культур Института Цитологии АН СССР (Ленинград) под номером 157D.
Штамм имеет следующие паспортные характеристики.
Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда RPM1-1640 или минимальная среда Игла в модификации Дальбенко с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; рН 7,4, t 37°С; 5% углекислоты в атмосфере или без углекислоты. Посевная доза 10 клеток в 1 мл. Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую культуральную посуду.
ел
Ивх&
О
Во Лпакон объемом 25 см3 засевают 5 ) клеток штамма и 5 мл среды. Проводят пассаж 1 раз в 4 дня той же дозой клеток. Без подсчета клеток 1:3-1:5. Через 3-4 дня концентрация антител л культуральной жидкости достигает 30-40 мкг/мп.
Для выращивания опухоли из штамма используются мыши линии BAL В/с. Свежим мышам за 5-25 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристава. Клетки штамма инъецируют внутрибрюшинно по 5 х 107 клеток на мышь в 0,5-1,0 мл среды 199. Асцитическую жидкость собирают по мере появления (на 12-14 день) многократно от живых мышей. Делают не менее трех взятий от каждого животного, объем асцита 4-6 мл. Концентрация антител в асцитической жидкости 6,0- 7,5 мг/мл, при определении методом торможения радиоиммуиоадсорбции. Из асцита штамм перевивается на свежих мышей по 5 х 101 клеток на мышь.
Кариологическая характеристика. Модальное число хромосом в клетках описываемого гибридомного штамма 78 с областью варьирования от 76 до 86.
Продуктивность. Стабильная секре- ция полезного продукта сохраняется до 30 пассажей in vitro с концентрацией антител в культуральной жидкости 30 мкг/мл и до 6 пассажей in vivo с с концентрацией антител в асцитической жидкости 6,0 мг/мл. ч
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы- явлено по окрашиванию красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.
Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в бычьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфотссида (концентрация клеток 5 клеток (в 1 мл), разливают в пластиковые ампулы при 4°С, помещают с толстостенную коробку из полипеноуретана и выдерживают 24 ч при -70°С, затем клетки переносят на хранение в жидкий азот. Возможно также программное замораживание со снижением температуры на 1°С в 1 мин до -40°С с последующим перено- сом в жидкий азот.
Размораживание осуществляется в течение 1 мин при 37°С. Клетки разводят в Ю мл среды для культивиро
Q 5 0 5
0
Q
г 0
5
5
вания, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды и переносят в посуду для культивирования. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 70-80%.
Характеристика целевого продукта. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом, относятся к 1q G1 подклассу и связывают гемагглютинин цельного вируса гриппа А (Ленинград) 385/80(H3N2) и выделенный с помощью детергента дезинтегрон-0. Взаимодействие антител с гемагглютинином вируса гриппа может быть выявлено способом, при котором гемагглютинин используется в качестве антигена как поверхностный гликопротеин вириона (твердофазный иммуноферментный анализ) или методом торможения гемагг пго- тинации, использующим МкАТ к гемаг- глютинину в качестве конкурирующего агента.
Использование штамма АН-РСК-4Н8 иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Моноклональные антитела используют в иммуноферментном анализе. Для этого полихлорвиниловые 96-луночные платы покрывают препаратом гемагглютинина вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (H3N2) или вирусными концентратами в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида (ЗФР) в концентрации 30 мкг/мп по 50 мкл на лунку. Спустя 8 ч, лунки промывают в трех сменах ЗФР в течение 10 мин. В дальнейшем отмывают аналогично. Инкубируют везде при комнатной температуре. Свободные валентности платы насыщают в течение одного часа 1%-ным раствором человеческого сывороточного альбумина в ЗФР, после чего лунки отмывают и добавляют в них культуральную среду от штамма, продуцирующую моноклональное антитело к гемагглютиннну вируса гриппа, по 50 мкл на лунку на 1 ч. Лунки отмывают и инкубируют с кроличьей антисывороткой против иммуноглобулинов мыши, разведенной в 100 раз в ЗФР в течение 1 ч. Избыток антисы- воротки1 отмывают и добавляют ПАП- реагент на 1ч. ПАП-реагент получают, готовя смесь культуральной среды от гибридомы АР - FC -2В4, продуцирующей моноклональное антитело против пероксидазы хрена, с перокси- дазой хрена (конечная концентрация
514
50 мкг/мп). После удаления избытка ПАП-реагента отмывкой пероксидазную активность выявляют добавлением окрашиваемого субстрата по 100 мкл на лунку.
Приготовление субстрата. К смеси 5,1 мл 0,2 М Na2liro4 и 4,4 мл 0,1 М лимонной кислоты добавляют 9,5 мл дистиллированной воды, рН доводят до 5,0 концентрированной ортофосфорной кислотой. В раствор добавляют 0,04% ортофенилендиамина (Sigma) и 0,05% перекиси водорода. Положительная реакция проявлялась желто-коричневым окрашиванием. Реакцию останавливают через 20 мин концентрированной серной кислотой (по 10 мкл на лунку).
Оптическую плотность в каждой лунке оценивают с помощью спектрофото- метра при длине волны 495 им. В контроля вместо моноклональкых антител к гемагглютинину вируса гриппа обработку проводят культуральной средой от миеломной линии с одной стороны и кроличьей сывороткой против вируса гриппа с другой.
Пример 2. Вместо вирусных антигенов на полихлорвиниловую плату адсорбируют кроличью сыворотку против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 (H3N2), разведённую в 100 раз ЗФР, при комнатной температуре. Спустя 8 ч, ее избыток отмывают, свободные валентности насыщают 1%-ным раствором человеческого сывороточного альбумина в ЗФР, лунки отмывают спустя 1 ч и добавляют вирусные антигены и другие компоненты, tак описано в примере 1.
П р и м е р 3. Моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа используют для торможения гемаг- глютинации с препаратом гемагглюти- нина А (Ленинград) 385/80 (H3N2) и различными вирусными концентратами в реакции торможения гемагглютинации.
Для постановки реакции торможения гемагглютинации готовят рабочее разведение антигена, в 50 мкл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (АЕ) вируса. С этой целью исходный антиген разводят изотоническим раствором (ИР) во столько раз, сколько получается от деления его гемагглюти- национного титра на 4.
Перед постановкой основной реакции проверяют, действительно ли в 50 мкл выбранного разведения содержится
5
0 5
о 0
5
0 g
5
106
4 АЕ. Для этого в 4 лунки разливают по 50 мкл ИР. В первую из них добавляют 50 мкл рабочего разведения антигена, после смешивания 50 мкл переносят во вторую лунку, из нее - в третью, затем в четвертую Из четвертой лунки 50 мкл жидкости выпивают. После этого в каждую лунку приливают по 50 мкл ИР и по 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов курицы. Таким образом, в 1-й лунке содержалось 2 АЕ, во 2-й - 1 АЕ, В 3-й4- 0,5 АЕ и в 4-й - 0,25 АЕ. В пятой лунке ставят контроль эритроцитов - 100 мкл ИР со 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов. Реакцию оставляют на 45 мин при комнатной температуре (до оседания эритроцитов в контроле).
При правильном выборе рабочей дозы антигена (4 АЕ) в 1-й и во 2-й лунках наблюдают полную агглютинацию, в 3-й лунке агглютинация была частичной или отсутствовала, в 4-й лунке агглютинации не было.
Готовят двукратные разведения моноклональных антител к гемагглютинину, инактивированных при 566С в течение 30 мин, по 50 мкл на лунку. Количество рядов двукратных разведений моно- клональных антител соответствуют количеству антигенов, к которым тестировали моноклональные антитела.
После того как мококлональные антитела разведены, во все лунки начального ряда вносят по 50 мкл рабочего разведения одного из антигенов, во все лунки следующего ряда разведений этих же антител по 50 мкл рабочего разведения др. антигена и т.д. Плату оставляют на 1 ч при комнатной температуре. После этого во все лунки всех рядов вносили по 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов и оставляют на 45 мин при комнатной температуре. Титром моноклональных антител считают их последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации. В контролях обработку вместо моноклональных антител проводят культуральной средой от миеломной линии и кроличьей сывороткой против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80(H3N2).
Результаты реакции торможения гемагглютинации представлены в таблице. Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus № ВСКК
№ ВСКК(П)157Г - продуцент монокло- нальных антител к гемагглютинину ви
руса гриппа А (Ленинград) 385/80 (H3N2).
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской вирусологии. Целью изобретения является получение гибридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину - поверхностному гликопротеину вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Для этого сливают клетки мышиной миеломы Х63-AQ 8-653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных препаратом гемагглютинина вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Полученный штамм культивируемых гибридных клеток имеет стабильные характеристики и депонирован в коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 157Д. Продуцируемые им моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, взаимодействуя только с штаммом вируса гриппа А/Ленинград/ 385/80 и не реагируя с другими штаммами вируса гриппа, относящимися к типу H3N2. 1 ТАБЛ.
Препарат гемагглюти- нина вируса гриппа А (Ленинград)385/80/ (H3W2)
Вирус гриппа А (Ленинград) 385/80 (H3N2) Вирус гриппа А (Чили) 1/83 R2(H1N1) Вирус гриппа А (Прага) 1/84 (H2N2)
1000 2000
