Способ выявления микобактерий туберкулеза Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии.

Для человека патогенными являются в основном микобактерий туберкулеза (МБТ) человеческого (Micobacterium tuberculosis) и бычьего (M.bovis) видов.

Целью изобретения является повышение специфичности выявления.

Цель достигается применением моно- клональных антител, продуцируемых гибридомным клеточным штаммом С2Д ВСКК (П), после инактивации микобактерий туберкулеза хлороформом в течение 4 ч, что позволяет сохранить структуру антигенных детерминант белков, присутствующих на поверхности микобактерий туберкулеза. Другие способы инактивации либо связаны с использованием дорогостоящего оборудования, длительной процедурой обработки (гамма-облучение), необходимостью большого количества биомассы (ультразвуковая обработка с последующим центрифугированием), либо приводят к денатурации белковых антигенных детерминант (фиксирование над пламенем на стекле, обработка формалином). Пример. 1 мг полувлажной бактериальной массы помещают в центр фарфоровой ступки. Заливают 3 мл хлороформа и накрывают крышкой от чашки Петри. По истечении 4 ч хлороформ испаряется, бактериальную массу тщательно растирают пестиком и по каплям добавляют 0,02 М клрбонатно-бикарбо- натный буфер (рН 9,6) до разведения 0,5 мг/мл. Для идентификации испольN

СО

оо со

СП

Од

зуют 0,8 мл полученной взвеси, остальное количество замораживают. По 0,2 мл испытуемой микробной взвеси вносят в 4 лунки полистироловой пластины, предварительно обработанной поли-Ъ-лизином (по 0,05 мл 0,001%-но- го раствора поли-Ь-лизина в фосфат- но-солевом буфере рН 7,4 заливают в лунки пластины, через 30 мин его собирают и хранят при -20°С для повторного многократного использования, оставшийся в лунках раствор поли-L- -лизина стряхивают). Инкубация с антигеном продолжается в течение ночи при 37 с. Затем лунки тщательно промывают: трижды водопроводной водой, на 1 мин пластину заливают водопроводной водой с 0,05% твина 20. Процедуру отмывки в такой последовательности повторяют трижды. Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят по 0,2 мл 10%-ного раствора яичного белка в 0,02 М фос- фатносолевом буфере рН 7,4. Через 1 ч лунки трижды промьшают водопроводной водой, после чего заливают по 0,2 мл 0,005%-ного раствора моноклональных антител С2Д ВСКК (П) в 0,02 фосфатно- солевом буфере с 10% яичного белка и 0,05% твина 20 (т.е. по 10 мкг моноклональных антител/0,2 мл).

Специфическое связьгеание антигена и моноклональных антител продолжается в течение 1 ч при комнатной температуре.

Далее лунки вновь тщательно промывают: трижды водопроводной водой и 1 НИН водой с 0,05% твина 20 и так три раза.

Для детекции комплекса антиген- антитело в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов мыши; меченные пероксидазой. Рабочее разведение 1:1000 в 0,02 М фосфатно-солевом бу- фере с 10% яичного белка и 0,05% твина 20. Инкубация продолжается 1 ч при 37 С.

После описанной трехкратной промывки лунок реакция проявляется с помощью 0,05 М цитратного буфера, 20 мл которого содержат 4 мг орто- фенилендиамина и 0,5 мл 0,5%-ной

.

5

0

5

0

5

В качестве контроля при идентификации бактериальных культур используют музейные штаммы микобактерий туберкулеза человеческого (положительный контроль) и бычьего видов, а также атипичные микобактерий, получен- ные в ГИСК им. Л.А.Тарасевица (отрицательные контроли).

В лунках, содержащих микобактерий туберкулеза человеческого вида, цит- ратный буфер окрашивается в желтый цвет, а в других (отрицательный контроль) он остается бесцветным. Реакция останавливается 50%-ной серной кислотой через 5-10 мин.

Предлагаемый способ иммунологической идентификации микобактерий туберкулеза человеческого вида является более специфичным по сравнению с прототипом. Достоверность ответа о видовой принадлежности возбудителя позво ляет использовать этот метод для проведения своевременных противоэпидемических мероприятий в очагах туберку- лезной инфекции, позволяет также прогнозировать течение заболевания. Простота и скорость осуществления иммунологического метода идентификации вида МВТ позволяет его использовать в практике фтизиатрии, а также в ветеринарии, где идентификация человеческого вида МВТ, полученных из тканей забитых животных, унимает вопрос об их эпидемиологической опасности, поскольку человеческий вид МВТ не является опасным для крупного рогатого скота.

Формула изобретения

Способ выявления микобактерий туберкулеза путем инактивации бактерий, их фиксации на твердой фазе, обработки специфическими антителами с последующей идентификацией иммуннот го комплекса меченной ферментом анти- глобулиновой сывороткой, отличающийся тем, что, с целью повьппения специфичности выявления Micobacterium tuberculosis, jмикобактерий инактивируют хлороформом в течение 4 ч, а в качестве специфических антител используют моноклоНальные антитела, продуцируемые гибридомным клеточньм штаммом С2Д ВСКК (П).

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение специфичности выявления микобактерий человеческого вида MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Цель достигается тем, что бактериальные клетки инактивируют путем обработки в хлороформе в течение 4 ч, после чего фиксируют на твердофазном носителе и проводят с ними иммунологическую реакцию с помощью моноклональных антител, продуцируемых гибридным клеточным штаммом 62Д ВЦКК (П). Предложенный способ надежен, легко воспроизводим, безопасен, требует для своего осуществления 2 дня в отличие от традиционных методов идентификации микобактерий туберкулеза, продолжающихся 1-3 месяца.