Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител (МкАТ) к микобактериям туберкулеза бычьего вида (M.bovis) и может быть использовано в медицине, в частности фтизиатрии, а также в ветеринарии.

Целью изобретения является получение .штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculusi, продуцирующих МкАТ к интактным M.bovis. Штамм получен гибридизацией клеток селезенки мышей линии ВА в/с. иммунизированных инактиви- рованными гамма-облучением полевыми штаммами M.bovis, с клетками миеломы Рз01 в соотношении 3:1 с помощью 50%-но- го полиэтилен гликоля (мол.м. 3550). Клеточную смесь разливают в 96-луночные

пластины по 2-10 спленоцитов на лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPM1-1640, содержащую 20% телячьей эмбриональной сыворотки, М гипоксантина, М аминоптери- на и 1, М тимидина. Культуральную жидкость гибридных клеток проверяют на содержание антител, специфически связывающихся с интактными M.bovJs в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). В результате из 1000-клеточных популяций отбирают гибридому 2А1, продуцирующую антитела, высокоспецифичные к M.bovis. Гибридомные клетки дважды клонируют методом предельных разведений по 1 кл. в лунку, содержащую в качестве подложки 4-10 кл. селезенки. После второго клонирования обнаружено 99% позитивных клонов.

Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей в культуре клеток.

Часть гибридомных клеток 2А1 замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% ДМСО в жидком азоте для хранения. Другую часть используют для получения опухоли в асцитной форме у мышей BALB/c введением внутрибрю- шинно 4-106 кл. животным, подготовленным внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл вазелинового масла за 3 - 30 дней до инъекции клеток. Асцит образуется через 20 - 25 дней. Из асцитической жидкости выделяют иммуноглобулины с помощью сульфата натрия (2,53 М раствора).

Штамм 2А1 хранится в Специализированной коллекции перевиваемы/, соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером 506 Д и характеризуется следующими признаками. Условия культивирования. Среда RPM1-1640 с 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ L-глутимина, 10 мМ пирувата натрия, аминокислотами для базальной среды Игла, витаминами для среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола и в атмосфере 5% углекислоты.

Для выращивания штамма используют пластиковую посуду. Посевная доза 100 тыс,кл./мл. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных.

Для выращивания опухоли пригодны мыши BALB/c. Свежим мышам за 3 - 30 дней до инъекции штамма вводят внутри- брюшинно по 0,5 мл пристана или вазелина. Штамм инъецируют внутрибрюшинно по 4 - 5 106 кл. в среде Игла. Асцит образуется через 20 - 25 дней. Штамм не перевивают. Продуктивность штамма: секреция моноклональных антител на 3 - 4-й день культивирования 40 - 50 мкг в 1 мл культу- ральной среды и 5 - 7 мг в 1 мл асцитической жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Характеристика полезного продукта: моноклональные антитела обладают избирательной специфичностью к поверхностным антигенам микобактерий туберкулеза бычьего вида. Стабильная секреция продук- .та сохраняется как минимум до 10 пассажей мн витро и при культивировании клеток в мышах в виде асцитной опухоли.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмой не обнаружена.

Криоконсервирование: 3,5 - 4,0-10 кл. штамма консервируют в 1,0 мл телячьей

эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание проводят в программном замораживателе по следующей

программе: температуру снижают до 4°С в 1 мин до 4°С и по 1°С в 1 мин до -40°К. Клетки хранят в жидком азоте. Разморажи1 вание: быстро при 37°С. Жизнеспособность после размораживания по включению три0 панового синего 80 - 85%.

Пример, Гибридомные клетки, храня- ющиеся е жидком азоте, размораживают быстро при 37°С, отмывают средой 199 и высевают в среду для культивирования, ко5 торая состоит из RPM1-1640 с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ меркаптоэтанола и выращивают при 37°С в атмосфере 5% углекислоты. По0 севкая доза 105 кл. в 1 мл, Через 3-4 дня концентрация антител в культуральной жидкости достигает 40 - 50 мкг/мл.

Специфичность взаимодействия антител с микобактериями туберкулеза бычьего

5 вида выявляют твердофазным иммуно- ферментным методом. Для этого на полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют убитые гамма- облучением или хлороформом микобакте0 рии: 0,1 мг культуры на ячейку в 100 мкл карбонат - бикарбонатного буфера (0,2 М; рН 9,6) при 37°С в течение ночи. После насыщения панели 10%-ным раствором яичного белка в фосфатно-солевом буфере

5 (0,02 М; рН 7,2) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят по 100 мкл культуральной среды штамма 506Д на 1 ч, после чего панель трижды отмывают водопровод0 ной водой, а потом водой с 0,05% Твина 20 и, наконец, вносят растворенный в но-солевом буфере с 10% яичного белка и 0,05% Твина 20 конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалент5 но-связанных с пероксидазой (на 1 ч при 37°С).

После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся пероксидазу,

0 а значит антитела против микобактерий туберкулеза, определяют по расщеплению субстрата (НаОа) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина.

Результаты иммуноферментного анали5 за специфичности МкАТ 506Д с микобактериями представлены в таблице.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МкАТ специфически реагируют с микобактериями туберкулеза бычьего вида.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П)

№ 506 Д-продуцент моноклональных антител к Mucobacterlum bovls.

Использование: биотехнология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией мышей линии Balb/c, иммунизированных суспензией инактивированных гамма-облучением штаммов M.bovis, выделенных от больных коров, с клетками миеломы РзО1. Секреция моноклональных антител на 3 - 4-й день культивирования составляет 40 - 50 мкг/мл и 5 - 7 мг/мл через 20 - 25 дней в асцитиче- ской жидкости. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 506Д. Моноклональные антитела могут быть использованы для идентификации микробактерий. 1 табл. со С

Микобактерия

M.bovls BCG (вакцина) M.bovls BCG {Омский ВНИИБТЖ) M.bovis Bov nus-8 (МНИИТ) M.bovls BovinuS-8(OMCKHu ВНИИБТЖ) M.bovis (штаммы, полученные от больных туберкулезом коров, ) M.tuberculosls (штаммы, полученные от больных туберкулезом людей, ) Атипичные микобактерии: M.kansasli

M.fortultum,

M.lntracellulare M.gastrll M.phley M.avlum

Мдеггае. i

M.martnum M.smegmatls.;

Показатель оптической плотности

0,59±0,01 0,65±0,01 1,19±0,01 0,55±0,01

0,63 ±0,03 0,04±0,01

0,06±0,005 0,06±0,01 0,04±0,01 0,04 ±0,01 0,04 ±0.01 0,04 ±0,01 0,03 ±0,01 0,05±0,01 0,06+0,01