(Л
С
Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных соникатами М, tuberculosis HsvRV, с клетками мышиной миеломы линии Х63- Ад653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000 при соотношении клеток селезенки с клетками миеломы 3:1. Штамм обозначен МТ-1 и депонирован под номером ВСКК(П) 488Д. Штамм продуциру- .ет моноклональные антитела, направленные к антигену микобактерий человеческого типа мол.м. 20 кДа. Титр антител достигает в культуральной жидкости 1:256, васцитиче- ской 1:25х103. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Изобретение описывает получение и свойства гибридного клона МТ-1 - перевиваемых мышиных клеток (гибридома), продуцирующих моноклональные антитела к микобактериям человеческого типа M.tuberculosls HayRV.
Получение указанного продуцента открывает перспективы усовершенствования методов серодиагностики туберкулеза, а именно определение проти- вотурбекулезных антител и антигенов микобактерий туберкулеза в сыворотках и других биологических жидкостях человека методами иммуноферментного анализа, радиоиммунологического и иммунофлюо- ресцентного анализа.
Имеются многочисленные данные по получению гибридом, продуцирующих .моноклональные антитела к бактериям. Однако представленное изобретение отличается тем, что полученная гибридома МТ-1 продуцирует моноклональные антитела (МкАт) к M.tuberculosls HavRV.
Получены МкАт к микобактериям туберкулеза человеческого типа. Штамм-аналог отличается от заявляемого штамма специфичностью: направленностью к другой антигенной детерминанте, а именно в 20 кДа.
Цель изобретения - получение МкАт, специфически реагирующих с микобактери- ями человеческого типа М.tuberculosis H37RV.
Цель достигается созданием штамма гибридных клеток путем слияния клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, иммунизированных соникатом M.tub. HayRV, способных к росту в мышах в виде асцитной опухоли и к продуцированию в асцитную жидкость в высоком титре.моко
ю
N Ю 4Ь.
О
клональных антител к антигену микобэкте- рий человеческого типа (M.tuberculosls
H37RV).
Штамм клеток МТ-1 депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР в г. Ленинграде под №.
Способ получения штамма. Мышей линии BALB/c иммунизировали подкожно в б точек 100 мкг сониката M.tub. в неполном адьюванте Фрейда двукратно, с интервалом в 2 недели. Бустерную дозу 40 мкг сониката вводили внутривенно за три дня до забора клеток селезенки для гибридизации, Титр антител, специфических к соника- ту HsyRV в сыворотке крови иммунной мыши, определялся методом иммунофер- ментного анализа с антигенами, которыми иммунизировали, и составлял 1:16 тысяч. Слияние спленоцитов с клетками мышиной миеломы линии Х63-Ад8653 осуществляли с помощью 50% раствора ПЭГ (полиэтилен- гликоль) 6000 (Merck) при соотношении кле- .ток селезенки с клетками миеломы 3:1. После процедуры слияния клетки суспенди- ровали в селективной среде ГАТ из расчета .ЗхЮ4 клеток/лунку 96-луночной панели. Через 7 дней после гибридизации панели просматривали с помощь инвертированного микроскопа. Рост гибридных клонов отмечался в 80% лунок. Методом иммунофер- ментного анализа (ИФА) через 14-17 дней .тестировали культуральную жидкость из лунок с растущими клонами на присутствие специфических антител. Для отбора гибридных клонов ИФА использовали набор анти- генов-соникатов из M.tub. HayRV, BCG, Intracellulare, Scrofulaceum, Fortuitum и E.coll.
Культуральные характеристики линии.
Среда для культивирования: среда RPM1-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера, 2 мМ L-глутамина, 5-Ю 5 М 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл гентамицина.
Характер роста: стационарная суспензия
Метод снятия: встряхивание Частота пассирования:2-3 суток Посевная доза: 2-3-10 клеток/мл Кратность рассева: 1:2-1:3 Консервация клеток: клетки заморожены после 1,3.10,15 и 25 пассажей в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Общее количество ампул - 30, по 4-5 млн клеток в ампуле. Криозащитная сре- да: эмбриональная телячья сыворотка с 10- 20% диметилсульфоксида. Режим
замораживания: клетки в криозащитной среде хранили 1-3 сут при -70°С, после чего помещали в жидкий азот. Выживаемость при размораживании - 80%,
Сведения о контаминантах линии: бактерии - нет, грибы - нет, микоплазма - нет,
дрожжи - нет.
Морфология культуры: культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток с обычной для гибридных антителообра- зующих клеток морфологией (округлые клетки с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы, ядрышки крупные, по 1-2 в ядре).
Кариология культуры: кариотип соответствует виду Mus.musculus, Модальное число хромосом - 89, интервал изменчивости от 78 до 92 хромосом.
П р и м е р 1. Культивирование гибридных клеток in vitro при посадочной концентрации 200 тыс.кл/мл ростовой среды, культура клеток инкубируется 2-3 сут в стационарном состоянии при 37°С в атмосфере 5% СОа. Концентрация клеток, превышая 1
млн/мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их гибель. Культуральную жидкость из флакона с 3-дневной культурой тестируют на присутствии моноклональных антител,
П р и м е р 2. Культивирование гибри- дрмных клеток in vivo: культивируемые In vitro клетки при концентрации, не превышающей 500 тыс/мл, т.е. находящиеся в логарифмической фазе роста, центрифугируют
ю1 при 200д. Осадок клеток после центрифугирования суспендируют и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. 5-7 млн клеток/мл вводят в брюшную полость мышей BALB/c,
предварительно обработанных пристанем, Обработку проводят однократно за 1-3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекций 0.5 мл пристана. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных
клеток) образуются асцитные опухоли. Количество асцитной жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей, в среднем составляет 5 мл.
П р и м е р 3. Активность и специфичность моноклонаяьных антител в ИФА. Для осуществления иммунохимической характеристики полученных МкАт из супернатантов культуры гибридомы МТ-1 и асцитной жидкости была выделена глобулиновая фракция
высаяиванием (МНфЗО при 50% насыщении. В глобулиновой фракции определяли количество белка спектрофотометрически при длине волны 260 и 280 нм (при разведении глобулина в 50 раз).
Характеристику специфичности полученных МкАт проводили с помощью ИФА. Для анализа использовали тот же набор ан- тигенов-соникатов, на которых проводили скрининг супернатантов при отборе клонов, Концентрация антигенов была 10 мкг/мл. Глобулиновую фракцию МкАт использовали в следующих концентрациях: 10, 2,5, 1,25, 0,625 мкг/мл. На сенсибилизированный антигенами и заблокированный 1% бычьего сывороточного альбумина планшет наносили по 25 мкл глобулинов МкАт в трипликатах для каждого антигена. Реакцию проявляли вторыми антителами против иммуногло- булинов мыши, меченными пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали 30% НаОа и ортофенилендиамин. Средние показатели оптической плотности трипли- катов при длине волны 492 нм представлены в таблице.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК (П) № 488Д - продуцент моноклональных антител к антиХарактеристика специфичности МкАт Мт-1. в реакции с соникатами
микобактерий в ИФА
0
5
На основании выполненного анализа было показано, что МкАт МТ-1 на высоком уровне связывались с соникатом M.tuberculosis , тогда как соникатом М. BCG реакция была более слабая, а с остальными соникатами связывание было на уровне фона реакции.
Использование полученных антител позволит повысить эффективность диагностики туберкулеза за счет увеличения специфичности иммунологических реакций при определении противотуберкулезных антител и антигенов микобактерий человеческого типа у больных туберкулезом, а также даст возможность раннего выявления инфицирования микобактериями туберкулеза при профилактическом обследовании людей.
20
гену микобактерий человеческого типа Mycobacterlum tuberculosis HayRV с мол.м, 20 кДа.
| Антибиотики и химиотерапия, 1988, 33, № 5, 352 | |||
| Lancet, 1981,25, 7, 167 |
