Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS ВСКК (П) N 62 D, используемый для получения моноклональных антител к МYсовастеRIUм тUвеRсULоSIS Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/40 

ш

йуют ллп получения гибридн ли в астштной форме у мыгте нведением внутрибр птинно ( клеток NfbmaM, подготовленн брюпинной инъекцией 0,5 мл нового масла за 3-30 дней НИИ ттамма Асцит образует дней.

Пол гченный штамм хранит циализированной коллек1ши ьгых соматических клеток п Института цитологии АН ССС ром 621) и характеризуется

Изобретениё .относится к биотехно-. логии и мохет быть использовано для .диагностики туберкулеза.

Цель изобретения - получение штамма гибридных куль.тивируемЫх клеток животных MUB mnsculuSj проду ирутоще г го специфические моноклональные ан- |титела (МКЛ) к цельным Mycobacterium tuberculosis а

OiTBMK получают следующим образом,

I-ibimett линии BALB/C иммунизируют авирулентным микобактерий туберкулеза Hj7 f q ° 4 инъекции по 0,2мг

полувлажной массы подкслно в -течение пими признаками. 5 месо Через 48 ч после трёх ежеднев-Культуральные признаки,

ньгх внутрибр япинных буст-инъекций по 0,2 мг белка сониката (надосадок разрушенных ультраг-луковой обработкой Микобактерий) равном соотнош.ении берут селезеночные кЛет- ки для проведения слияния. Гибридн-. зацию селезеночных клеток й- клеток мышиной миеломы проводят в соотяогаенйн 5:i с помощь 50-% полиэтилен-25 Фере 5% углекислоты. гликоля (мол, к о 3500). .1Слеточнук сме.сь разливают в 96-луночные плзстй- нь: по 210 спленоцитов на лунку,

Дпя культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 Q с добавлением 107 лошадиной и 10% те20

RPM1-1640 с 10% телячьей ной сыноротки и 1П% лошади ротки 4.мМ L-глутаминя, Пенициллина, 100 мкг/мл ст на, 10 мМ пирувата натрия, лотами для базальной среды таминами ДПЯ среды Игла, 6 м ркаптоэтанола, при 37 С

лячьей эмбриональной сыворотки 0 М гппоксантина, 4 -lO М аминоптерина и ItS lO M тимидина, Культуральяую жидкость, гибридных клеток проверяют на содержание антител, специфически связывающихся с антигеном микобактерий человеческого вида штамма (надосадок разруиенных ультразвуком микобактерий) в твердофазной радиоиммунной реакции. Отобранный иэ 500 I гибридных клонов клон 502 продуцирует в культуральнувд жидкость ан титела, связьгоающиеся в радиоиммун- ной и ш-1муноферментной реякци- ях лишь с антигенами , - Клетки этого клона дважды клонируют методом конечных разведений по 2 клетки на лунку, содепжащун) в качества подложки 440 клеток , селезенки После второго клонирования 98% субклонов продуцирумт антителя указанной выше специфичности. Их продукция сохраняется в течение 8 пассажей в культуре клеток. Чисть тибридомнь х клеток 5G2 Замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% ДМСО в )шдком азоте для хранения . Другую часть нспсхпьДпя выршцивания штамма пластиковую посуду; посевн 100 тыс, клеток/МП, клетки 1 раз в 3-4 дня, кратность IJlO, Культура суспензионн

Дпя вьфащивания опухоли ны мьши BALB/C, Свежим мьш 30 дней до инъекции штамма внутрибрюшинно по 0,5 мл в го маспа. Штамм инъецируют

бркяпинно по (2-5) Ч О гшет

40

45

50

55

среды Игла, Асцит образует 12-16 дней. Штаммы не пере

Продуктивность татамма, моноклональных антител на культивирования составляет 55 мкг в 1 мл культурально и 6-8 мг в 1 МП асцитическ ти при определении методом ния радиоиммуноадсорб1дии,,

Характеристика полезног та, МКА относятся к классу обладают избирательной спе к антигенам Mycobaoteriura sis. Стабильная секреция п сохраняется до 8 пассажей ; Контаминация. Контамина риями, грибами микоплазмой ружена,

Кркоконсервирование, (0 клеток штамма консервируют телячьей эмбриональной сыв добавлением 10% диметилсул в пластиковых ампулах, Зам

йуют ллп получения гибридной опухоли в астштной форме у мыгтей BAloR/c нведением внутрибр птинно (2- i) клеток NfbmaM, подготовленным внутри-: брюпинной инъекцией 0,5 мл вазели- , нового масла за 3-30 дней до инъек-| НИИ ттамма Асцит образуется через дней.

Пол гченный штамм хранится в Специализированной коллек1ши перевивае- ьгых соматических клеток позвоночнь К Института цитологии АН СССР под номером 621) и характеризуется следугапими признаками. Культуральные признаки,

Среда

RPM1-1640 с 10% телячьей эмбриональной сыноротки и 1П% лошадиной сыворотки 4.мМ L-глутаминя, 100 мкг/мл Пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, аминркис- лотами для базальной среды Игла, витаминами ДПЯ среды Игла, 6,05-мМ м ркаптоэтанола, при 37 С и в атмосФере 5% углекислоты.

Дпя выршцивания штамма используют пластиковую посуду; посевнай доза 100 тыс, клеток/МП, клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева IJlO, Культура суспензионная,

Дпя вьфащивания опухоли пригодны мьши BALB/C, Свежим мьшам за 3 - 30 дней до инъекции штамма вводит внутрибрюшинно по 0,5 мл вазелинового маспа. Штамм инъецируют внутри-

бркяпинно по (2-5) Ч О гшеток в 1

МП

0

5

0

5

среды Игла, Асцит образуется через 12-16 дней. Штаммы не перевивали, .

Продуктивность татамма, Секрег1;ия моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 45 - 55 мкг в 1 мл культуральной средь1| и 6-8 мг в 1 МП асцитической жидкос- ти при определении методом торможения радиоиммуноадсорб1дии,,

Характеристика полезного продукта, МКА относятся к классу IgG, Они обладают избирательной специфичностью к антигенам Mycobaoteriura tuberculosis. Стабильная секреция продукта сохраняется до 8 пассажей in vitro, ; Контаминация. Контаминация бактериями, грибами микоплазмой не обнаружена, . 6Кркоконсервирование, (0,7 - 1)10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах, Заморато вание

3li

программном ял ;оражинапроводят в теле по с.ледумпей npnrpaNfMe: температуру снижают по А С в I мян до Д С и по I с в 1 мин до -40° . 1Слетки хранят в жидком аяоте, Раяморакивание: 6t4CTpo при 37°С. Жизнеспособтюсть после размораживания по включению трипанового синего 70-80%.

Пример, Гибридомные клетки, хранящиеся в жидком азоте, размораживают быстро при , отмывают средой 199 и высевают в среду для куль- тивировАния, которая : состоит из НРМ1-16ДО с,добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, А мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата а, 00 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пeнициллинa., кислот для базальной среды Игла, витаминов для среды Игла и 0,05 мм мер- каптоэтанола и выраагивают при 37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты. Посевная доза 10 клеток в 1 мл. Через 3-4 дня концентрация антител в куль- туральной жидкости достигает 45 - 55 мкг/мл,

.Специфичность взаимодействия антител с ми кoбaктepия ш туберкулеза человеческого вида выявляют твердофазным иммуноферментнъп-1 ме°тодом. Для этого на полистироловую 96-луночнум панель для микротитрования сорбируют убитые гамма-облучением микобак- терии: 100 мкг культуры на ячейку в 200 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера (0,02 М, рН 9,6-) при в-течение ночи. После насыщения панели 10%-ным раствором яичного бел- ка в фосфатно-солевом буфере (0,02 М рН 7jA) для зтеньше гая неспецифш1ес- кого связывания антител пластиком в ячейки панели вносят 200 мкл культу- ральной среды штамма 502 на 1 ч,пос- ,ле чего панель трижды отг-1ывают водо

0

5

84

проводной водой, а потом водой с 0,05% твина 20 (процедуру oт fъrвки повторяют трижды), пиосят конъюгат антител кролика против иммуноглобу-- линов мыши, ковалентно связанных с пероксидазой (1:1600, 37 С, ч) После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся перок- сидазу (а значит, и антитела против микобактерий туберкулеза) определя ют количественно по расщеплению субстрата ().

Штаммы микобактерий имеют следующие п бказатели оптической плотности

М. Н

bf. БЦЖ - М, bovinus-8 Клинические культуры (выделенные от больных) п 96 М. aviuTO f. serofulacctnn М. infracellu- larae

М. kansasii М. Smegmatid М. fortttituin

0,95± 0,05

0; П i 0,02

0, 1,37± 0,14

0 0

0 0 0 0

Эти результаты свидетельствзтс.т о том, что полученные MICA спе5Ц фичае- ки взй1П 1Одействук)т с Mycobacterixm tuberculosis, что позволяет получить, на их основе эффективные дзтагности ческие препараты.

Формула изобретения

Штамм гибридных кyльтив фye Ы t клеток животных T-fus musculus ВСКК (п) N 62 D иcпoльзye sый для получе ния моноклональных антител к Мусо- oacterivtm tuberculosis.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики туберкулеза Целью изобретения является полз генне штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные -антитела (МКА) к цельным микобактерням чепопака штамма ,,. получают гнбр; :-- дизацией клеток селезенки, мыгаей BALB/C, иммунизированных авируленэ ным штаммом , с клетками мие- ломы PJ О. Секреция МКА на 3-4 деш культивирования составляет 45 - - 55 мкг/мл культуральной среды и б - 8 мг/мл асцитической жидкости М5СА относятся к классу они специ - чески связы1эаготся с антигенами цель- ных микобактерий человека Hj7 Чр 1 табл.