Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к тяжелым @ -цепям иммуноглобулина человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для тестирования иммуноглобулинов человека (IgM).

Цель изобретения - повышение специфичности моноклональных антител.

Штамм - продуцент моноклональных антител (МАТ) получают следующим образом.

Мышей линии BAL В/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 200 мкг препарата IgM человека (поликлональ- ный) в 0,5 мл физиологического раст- врра, забуференного фосфатами (ЗФР) (5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2- 7,4, 150 мМ NaCl), с полным адъю- вантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 23 дня, вводя внутрибрю- шинно 200 мкг того же препарата в ,ЗФР без адъюванта. Через 3 дня после зтого 1x10® клеток селезенки иммунных мьшей гибридизуют с 6x10 клеток миеломы мьш1и X63-Ag8-653 помощью 0,4 MJ 45%-ного раствора полиэтил енгликоля (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульфо- ксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки от ПЭГа клетки высевают в 9б-луночные панели по 2x10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI-1640I с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, гипоксантина,.

4

QD 00 О) О 00

М аминоптернна и 1, ти- мидина. Гибриды - продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют антитела к IgM.

Полученный штамм обозначают 9С11В8-1, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(И) № 74D и характеризуется следующими признаками,

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования ,

Среда RPMI-1640 или DMEM с 10% донорской телячьей сыворотки, 4 мм L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37°С и в атмосфере 5%-пого СО. Для выращивания штамма использовали пластиковую посуду; посевная доза - 100 тыс.клеток на 1 мл, клетки пассировали один раз в 3-4 дня, кратность рассева- 1:10. Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных.

Для выращивания асцита пригодны BAL В/с. Мышам за 7-10 дней до инъекции клеток штамма вводят внутри брюшинно по 0,5 мл пристана. Ютетки инъецируют пнутрибрюшинно по 2-5x10 клеток в 1 мл среды Игла, Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклонального антитела на 3-4 день культивирования составляет 15-20 мкг в 1 мл культуральной среды и 5 мг п 1 мл асцитной жидкости при определении методом торможе- ния радиоиммуноадсорбции.

Характеристика полученного продукта .

Штамм продуцирует моноклональное антитело, относящееся к IgG I клас- са. Специфичность - IgM человека. Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание монАТ им- моОи. 11ии1ранным IgM человека (радио- иммунный анализ - R1A).

Антигон наносят на пластик, 2 мкг в 100 tiKJi ЗФР (см.описание штамма) и инкуГщр уют н течение ночи. Затем, поело 1;тим1 ки, наносят тестируемую

культуральную среду и после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител мечеными 125 кроличьими антимышиными антителами. Все отмывки ведут ЗФР с 0,05%-ным Твин-20. Контролем служат нормальные иммуноглобулины мьппи.

Продукция монАТ сохраняется как минимум до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме,

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсуль- фоксида. Режим замораживания: 4 /мин до 4 С затем 1 /мин до -40°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бане при +37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания - 70-80% по окрашиванию трипановьм синим.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено методом гибридизации рес- триктов клеточной ДНК с универсальным и видоспецифическими диагностическими зондами, содержащими фрагменты геномов различных микоплазм.

Моноклональное антитело, продуцируемое клетками штамма 9С11В8-1, относится к Ig G1 подклассу и связывается с эпитопом R. -области тяжелой цепи ш-класса иммуноглобулина человека. Специфичность взаимодействия монАТ может быть выявлена способом, при котором в качестве антигенов используют иммуноглобулины человека, иммобилизованные на пластике (твердофазный радиоиммунный или имму ноферментный анализ).

Иммунохимические свойства МАТ 9С11В8-1, Для получения препарата МАТ в количестве, необходимом для проведения всех иммунохимических исследований, гибридомные клетки штамма-продуцента помещают в пластиковый флакон площадью 25 кв, см, 2х10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 100 мкг-мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере Ь%-ного СО, Полученный суперна5

тант используют в качестве реагента в иммунохнмнческнх реакциях.

Пример 1.Тестирование специфичности взаимодействия монАТ с анти генами методом твердофазного радио- иммуного анализа (РИЛ).

На полихлорфиниловую 96-ячеечную панель (Flow) для микротитрования сорбируют антиген - 2 мкг на ячейку в 100 мкл ЗФР при 4°С в течение ночи После насыщения панели 0,05%-ным раствором Твин-20 в ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком, в ячейки вносят по 100 мкл культуральной среды штамма 9С11В8 и инкубируют 1 ч при . После этого панель отмывают три раза по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и вносят антитела кролика к иммуноглобулинам мыши, меченые 125-) (препарат с удельной активностью 0,8x10 срп1 на мкг, по 0,2x10 срт в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на ячейку). После инкубации в течение 1 ч при 20°С панель трижды промывают ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и просчитывают на Minigamma счетчике.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания МАТ, продуцируемого клетками штамма 9С11В8- , с антигенами, сорбированными на пластике, представлены в табл.1.

В качестве отрицательного контроля, учитывающего возможную неспецифичную сорбцию монокпональных антител мыши на антигенах, использована культуральная среда, реагирующая только с иммуноглобулинами гамма- класса (анти-lgG).

Неспецифическ:ч ю сорбцию мечень х антител кролика против Ig мыши (анти-Ск) определяют путем их инкубации непосредстненно с иммобилизованными антигенами; уровень фона составляет 300-900 имп/мин для разных антигенов. Цифры пр1 ведены за вычетом фона неспецифической сорбции.

Данные, приведенные в табл.1, четко показывают, что реакция с Ig М в 15-20 раз превышает реакцию с антигенами, не имеющими эпитоп-мишень (1§ нор м ч L ррд,) .

Результаты этог о примера свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального ан мпела, вырабатываемого клетками uiraMMa 9С11В8-1, и показывают возможность применения

93668

МАТ для выявления иммобилизованного антигена с помощью радиоиммунохими- ческого метода.

Пример2. Тестирование специфичности взаимодействия монАТ с антигеном методом твердофазного им- муноферментного анализа (ELISA). Для проведения иммунохимических

10 реакций в системе KLISA на поли- стирольную панель сорбируют антиген (10-20 мкг/мл в 50 мкл ЗФР) в ЗФР в течение ночи и после отмывки инкубируют 1-2 ч при 37 С в ЗФР с 1%15 ным BSA для снижения неспецкфической сорбции. Тестируемую культуральную жидкость наносят в объеме 50 мкл и инкубируют в тех же условиях. После отмывок ЗФР с 1%-ным BSA проявле20 ние ведут раствором кроличьих антител к Ig мьшти, конъюгированных с пе- роксидазой хрена. Ферментативную реакцию с ортофенилендиамином (OPD) останавливают через 10 нин H..

25 Раствор субстрата для проявления пе- роксидазой активности готовят: 5 мг OPD растворяют в 10 мл буфера (состав буфера - 24 мл 0,1 М лимонной кислоты, 26 мл 0,2 М ., 50 мл

30 ). Непосредственчо перед проведением реакции к раствору OPD добавляют 10 мкл перекиси водорода.

Данные, полученные иммуноферментным методом, приведены в табл.2. I

35 Огрнцательньм контролем является ферментная реакция при непосредственной сорбции на антигенах конъю- гата пероксидазы хрена с антителами кролика к Ig мыши.

О Цифры в скобках означают число антигенов, на которых наблюдается указанная реакция (числитель) из всех использованных антигенов рассматриваемого класса-подкласса (зна45 менатель).

Результаты ELISA показывают, что положительная реакция наблюдается только с IgM человека. Отсутствие реакции с F(ab)2,, -фрагментом при

50 положительной реакции с FC-фрагмен- том молекулы IgM свидетельствует, что эпитопмищень локализован на одном из постоянных доменон /к -цепи (кроме С, И) „

55

Таким образом, приведенные примеры четко демонстрируют абсолютную специфичность МАТ 9С11В8-1, относя- щегося к IgCI классу мышиных иммуноглобулинов, в отношении человеческих иммуноглобулинов класса IgM и возможность применения МАТ в различных вариантах иммунохимического анализа (радиоиммунный и иммуноферментный), К важным для практики свойствам МАТ 9С11В8-1 относится способность окрашивать лимфоциты периферической крови человека методом непрямой им- мунофлуоресценции, а также возможность получения асцитной формы штамма в линейных мышах.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (11) № 74D - продуцент моноклональ- ных антител к тяжелым 1Ц-цепям иммуноглобулина человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для тестирования иммуноглобулинов человека (JGM). Цель изобретения - повышение специфичности моноклональных антител. Для получения штамма мышей иммунизируют JGM человека. Через 3 дня клетки селезенки иммунных мышей гибридизуют с клетками миелассы мыши Х63-Ад8-653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 74 D И ПРОДУЦИРУЕТ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, ОТНОСЯЩИЕСЯ К JGG 1 КЛАССА. НА 3-4-Й ДЕНЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИЯ АНТИТЕЛ 15-20 МКГ/МЛ СРЕДЫ И 5 МГ/МЛ АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ. ПРОДУКЦИЯ СОХРАНЯЕТСЯ ДО 20 ПАССАЖЕЙ IN VITRO И 3 ПАССАЖЕЙ В АСЦИТНОЙ ФОРМЕ. 2 ТАБЛ.

Таблица

Тестирование специфичности монАТ 9С11В8-1 методом РИА, имп/мин

Таблица2