Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS (BCG) Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/40 

Изобретение относится к биотехнй- огин и может быть использовано для иагностики туберкулеза.

Целью изобретения является получе. - ие штамма гибридных культивируемьгх леток животньк Mus musculus, продуцирующего ,моноклональньге антитела МКА)5 специфически взаимодействуюие с микробактериями вакцинного штам- д ма БЦЖ. . Штамм получают. следу5ощим образом.

Мьппей линии BALB/c иммунизируют аЙ1фулентным ютаь1мом микобактерий туберкулеза Н„Наг А инъекции по 15 0,2 мг. полувлажной массы .подкожно в течение 5 мес. Через А8 ч после трех еж едневнызс внутрибрюшйнных буст инъекций по 0,2 мг белка сониката (надосадок разрушенных ультразвуко- 20 вой обработкой микробактерий) и БЦЖ в равном соотношении берут селезеночные клетки для проведения гибридизации. Слияние селезеночных клё- ток и клеток, мышиной миеЛомы Р.01 25. проводят в соотногаейии 5:1 с помощью 50%- полиэтиленгликоля (мол,м.3500). Клеточную смесь разливают в 96-лу ночные пластины по 2-10 спленоци- тов на лунку. Для культивирования и ;зО селекции гибридов используют йреду с добавлением 10% лошадиной сыворотки 10% телячьей эмбрио- .нальной сыворотки, 10 М гипоксанти- иа,- 4 ) гипоксантина, , аминоптерина и 1, тимидина, К.ультуральную жидкость гибридных клеток проверяют на содержание антител, специфически связьшающихся с антигеном микобактерий человеческого ви- до да Н„Ку и бычьего вида - БЦЖ (надосадок разрушенных ультразвуком мшсоб актерий) в твердофазной радиоиммунной реакции.

Отобранный из 500 гибридных клонов 45 клон 2А5 продуцирует в культуральную среду антитела, связывающиеся в ра- диоимунной и иммуноферментной реакциях с антигенами микобактерий бычье- го вида (штамма БЦЖ и в меньшей сте- CQ пени музейного штамма Bovinus-S), Антигены микобактерий различных видов и шт.аммов получают путем ультра - звэтсового разрушения .бактериальных клеток с последующим их 11ентрифуги . е рованием npVi 5000 g и используют пернатант в качестве антигена (сони- кат), Кпетки клона 2Л5 дважды клонируют методом предельных разведений

по 2 клетки в лунку, содержащую в качестве подложки клеток селезенки, После второго клонирования число позитивных клонов 99%. Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей в культуре клеток. Часть гибридомных клеток 2АЗ замораживают в змбриональной телячьей сыворотке с добавлением I0% ДМСО в жидком азоте для хранения. Другую часть используют для получения гибридной опухоли в асцитной форме у мышей BALB/c введением внутрибрюшинно 10 клеток мышам, подготовленным внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл вазелинового масла за 3-30 дней до. инъекции клеток. Асцит образуется через JO-16 дней. Из асцитической жидкости выделяют иммуноглобулины с помощью сульфата аммония . Штамм 2А5 хранится в Специа- лизироваиной коллекции перевиваемьгх соматических клеток позвоночнйх Института цитологии АН СССР по номером 60D и характеризуется следующими признаками,

Хультуральные признаки.

Среда RPMI-J640 с 10% телячьей эмриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, ЮО мкг/ пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 пирувата натрия, аминокислотами для базальной среды , витаминами для среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты.

Для выращивания штамма используют пластиковую посуду. Посевная доза 100 тыс,клеток/мл. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, Культура суспензионная.

Культивирование в организме живот . ных,

Для выращивания опухоли пригодны мыши BALB/C. Свежим мьш)ам. за 3- 30 дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 вазе;гинового масла. Штамм инъецируют внутрибрюшинно по ГО клеток в I мл среды Игла, Асцит образуется через Ю-16 дней Штамм не перевивали.

Продуктивность штамма.

Через 3-4 дня концентрация антите в культуральной жидкости составляет 40-50 мкг/мл, в асцитической 7- .8 мг/мл. Стабильная секрелия продукта сохраняется до 8 пасс.чжен in vitro.

Характеристика полезного продукта

МКА относятся к классу IgG, они специфически реагирует с антигенами микробактерий быМьего вида штаммов bovinus-8 и БЦЖ, Контаминация бактериями, грибами, микоЬлазмой не об- йаружена.

Криоконсервироваиие: 0,7- 1-10 клеток штамма консервировали в 1 мл телячьей эмбиональной сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание проводили в программном эамораживате- ле по следующей программе: температу- ру снижали по А С в минуту до 4 с и -по 1°С в минуту до -АО° С. .Клетки хранят в жидком азоте. Размораживание: быстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживания по включению трипа- нового синего 80-90%.

II р и м е р. На полистироловую 96-лунрчную панель-для микротитрования сорбируют убитые гамма-облучением микобактерии - 100 мкг культуры на ячейку в 200 мкл карбонатно-бикар- бонатного буфера (0,02 М, рН 9,6), при 37 С в течение ночи. После насыщения панели IO/J-ным раствором яичного белка в фосфатно-солевом буфере (0,02 М, рН 7,4) для уменьшения неспецифического связьшания антител пластиком н ячейки панели вносят 200 мкл культуральной среды штамма 2А5 на 1 ч, -после чего панель трижды отмьшают водопроводной водой, а потом водой с 0,05% твина-2б (процедуру отмьшки повторяют трижды), вносят конъюгат антител кролика против им

муноглобулинов мыши, крвалентно свя- занных с пероксидазой (1:J600, 37 С, 1 ч). После окончан1тя инкубации нё- связавшиеся продукты реакции отмьгаа- ют указанным вышесгюсобом, а связавшуюся пероксидазу, а значит и анти- тела против микобактерии БЦЖ, определяют количественно по расщепле

нию субстрата (Hjbj)B присутствии хромогена - ортофенипендиамина; Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием н количествеи- но учитьшается с помощью сканирующего спектрофотометра при длине волга 1 490 нм.

Результаты исследований представлены в таблице.

Штамм микробак- тернй

Показатель оптической плотности

Н„ПУ (человеческий

35

40 45

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МКА спецнфнчески реагируют с микобактериями туберкулеза бычьего вида - БЦЖ (и слабее с Bovl- nus-8).

Формула изо б р, е т е Н я я

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculue ВСКК (П) N 60D, используемый для получения моноклональных антител к fyc6- bacterium bovie (BCG).

Изобретение относится к биотехнологии н может быть использовано , для диагностики туберкулеза. Целью, изобретения является получение штамме гибридных культивируемых клеток животных MUS mosculus, продуцирукщёго моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие с микробактериями вакционного штамма БЦЖ. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей лииии BALB/c, иммунизированных авирулентным штаммом с клетками миеломы Pj 01, Через 3-4 дня культивирования концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 40-50 мкг/мл, в асцнти- ческой - J-8 мг/мл. МКА относятся к классу IgG, они специфически взаимодействуют с микробактериями бычьего вида БЦЖ (и слабее с Bovinue 8), 1 табл.