Способ получения простагландинов Советский патент 1989 года по МПК C07C177/00 C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии простагландинов (ПГ) и представляет собой новый способ получения ПГ, которые могут быть использованы как лекарственные средства в медицине и сельском хозяйстве.

Цель изобретения - повьшение выхода продукта.

Способ осуществляют путем инкубирования арахидоновой кислоты с буфер- ным экстрактом актиномицета Strepto- myces spheroides, штамм ВКПМ S-573 (фермент липоксигеназа) при 37 jO, в течение 7 мин при аэрации, осаждения белков, экстракции и-хроматогра- фирования.

Пример 1. Актиномицет Act. spheroides М8-2 выращивали на скошенном мясопептонном агаре при в течение 10 дн. Затем культуру актиномицета с одной пробирки переносят в 200 мл питательной среды содержащей, г/л: соевая мука 20; серно-кислый аммоний 3; хлористый натрий 2,5; однозамещенный фосфат калия 0,75; углекислый кальций 3, для выращивания посевного материала.

Посевной материал выращивают на качалках (180-200 об/мин) в колбах емкостью 750 мл с 200 мл среды в каждой в течение 72 ч при 28 С. Затем посевной материал в количестве 5% вносят в синтетическую среду извест-. ного состава, г/л: глюкоза 70; цитрат натрия 4, 48; серно-кислый магний 5,75; серно-кислый аммоний 1,25;

;о

СХ)

ел

однозамещенный фосфат калия 2,0; сеино-кислый цинк 0,01; серно-кислое железо 0,02, и выращивают тем же способом в течение 3 сут при . Выделение мицелия и получение экстракта.

.Культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин, осадок 3 раза промьшают физиологическим раствор&м, отделяя промывные воды.

К 50 г (сырая масса) отмытого мицелия вносят 20 мл 0,01 М трис-НС1 буфера рН 8,0, Полученную суспензию подвергают разрушению посредством УЗ Разрушение проводят в условиях постоянного охлаждения (температура не вьше ) при 22 кГц, 220 В, общее время разрушения 3 мин, интервал обработки УЗ составил 3 с с перерывом в 2-3 мин для устранения ности инактивации ферментов в результате разогрева.°

Полученную после разрушения УЗ суспензйо центрифугировали при 18 тыс. об/мин в течение 20 мин при охлаждении.

Полученный буферный экстракт, содержащий 360 мг белка в 100 мл 0,01 М трис-НС буфера рН 8,0, использовали в реакции биосинтеза прос тагландинов.

Пример 2. К 12,4 мг арахи- доновой кислоты (95%-чистоты) при- бавляют 360 мл белка актиномицета Str.spheroides в ТОО мл.°трис-НС1 буфера рН 8,0; 5,7 мг гидрохинона. Через раствор пропускают воздух при 37 t 0, в течение 7 мин, затем добавляют этиловый спирт в соотиоше- НИИ- 1:7 (V/V), экстрагируют проста- гландины этилацетатом, хроматогра- фируют на койрнках с кремниевой кислотой FOCI 4214-70, вымывая проста- гландины 15%-ным метанолом в этила- цетате. Получают 3,75 мг ПГРд, 1 мг ПГЕз, 0,5 мг ПГАз 0,3 мг ПГВд. Анализ простагландинов. УФ-спектроскопия. Образец ПГ расворяют в этиловом спирте и снимают сйектр в УФ-областп света. Имеется поглощение при i, 224 нм и 280 мм что соответствует простагландинам групп А и В. Образец ПГ изомеризуют в щелочной среде по известной методи ке, снимают УФ-спектр - имеется поглщение приХ„ц с280 нм, что соответсвует ПГЕд.

К 0,02 г образца добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и оставляют при комнатной температуре на 2-3 ч. Затем добавляют 2 мл спирта и снимают спектр в Уф и видимой области света 21,0 - 540 нм. Имеется поглощение-при / 304, 330, 465 и 528 нм, что. соответствует простагландинам группы F и при 354, 365, 452, 477 нм, что соответствует ПГЕз.

Тонкослойная хроматография. Выполняют на пластинках Silufol со свидетелями ПГ фирмы Serva в системах 1. хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (90: 8:1:0,8)

Rf ПГР 0,18-0,20 ПГЕд 0,38-0,40 в ПГАз + nrBg 0,6-0,55

|5 20 25

30

,с дд 50

55

2.бензол - диоксан - уксусная кислота (20:20:1)

Rf ПГЕд 0,75-0,80 nrFj 0,6-0,65

3.серный эфир - метанол - уксусная кислота (90:1:2)

Rf nrFs 0,2-0,25 ПГВд 0,35-0,40

Биотестирование образцов ПГ осуществляли на полоске матки или кишки крысы, наблюдая увеличение амплитуды сокращения и учащение ритма.

Радиоизотопный метод. Для тестирования образования ПГ использовалась арахидоновая кислОта меченная по углероду, с последующей тонкослойной хроматографией. Идентифицированы nrFjijj, nrEg, nrAs+ nrBs.

Предлагаемый способ обеспечивает более высокий выход ПГ.

Форм у л а изобретения

Способ получения простагландинов, включающий ферментативную конверсию арахидоновой кислоты с последующей экстракцией органическим растворителем и хроматографическим выделением продукта, отл,ичающийся тем, что, с целью по Атшення выходе продукта, в качестве ферментного препарата используют экстракт Strep- tomyces spheroides ВКПМ S-573, про- .

51497Т856 ,

дукт экстрагируют этилацетатрм , а дом колоночной хроматографии на крем- выделение и очистку вьтолняют мето- ниевой кислоть.

Изобретение относится к биотехнологии простагландинов (ПГ) и представляет собой новый способ получения ПГ. Цель изобретения - повышение выхода продукта. Способ осуществляют путем инкубирования арахидоновой кислоты с буферным экстрактом актиномицета STREPTOMYCES SPHEROIDES ВКПМ S-573 (фермент липоксигеназа) при 37°С в течение 7 мин при аэрации, осаждения белков, и экстракции и хроматографирования. Степень конверсии арахидоновой кислоты составляет до 50%.