Штамм актиномицетов @ @ @ 8-2-продуцент тромболитических ферментов,специфичных к фибрину Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 C12N9/68 

1чЭ

Изобретение относится к микробиологическому производству фибринолити ческих ферментов и представляет собо новый штамм актиномицетов рода Act nomyces, используемый для получения ферментов, гидролизующих фибрин и тромбы крови человека и являющихся перспективным при лечении тромбо-эмболических осложнений при сердечнососудистых заболеваниях. Изобретение может быть применено в микробиологии медицине и медицинской промышленности. Известен способ получения тромболитических ферментов, специфичных к фибрину, предусматриващий совместно культивирование микроорганиз| а-продуцента Nocardia species, шт. 1 и ми роорганизма-стимулятора Агthrobacter citreus, шт. 8-65. .При культивирова НИИ микроорганизмов в течение 72 ч фибринолитическая активность составл ет условных ед./мл, специфичность к фибрину ,7 время растворе ния тромба 1,5 ч 1 . Наиболее близким к предлагаемой по технической сущности является штамм актиномицетов Actinomyces ther movulgaris T-5 продуцент фибринолитического фермента С2 J. Недостатками этого штамма являютс низкая активность фибринолитических ферментов в культуральной жидкости при выравнивании на синтетических сре дах (1900 ед/мл), низкая активность фибринолитических ферментов в препаратах, низкая тромболитическая акТИРНОСТЬоЦелью изобретения является получение штамма рода Actimonyces продуцента тромболитических ферментов, специфичных к фибрину с высокой тром болитической и фибринолитической активностью. Предлагаемый штамм получен путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов из исходног штамма Actimomyces spheroides 35. Полученный штамм имеет следующие морфологические и физиологические хй рактеристики. Морфологические характеристики. Штамм имеет короткие спиральные спор носцы с 1-2 неплотно сжатыми завитками. Споры овальные с гладкой поверхностью. На средах штамм имеет следующие культуральные признаки. Среда Чапека с глюкозой. Рост хороший, воздушный, мицелий белый, белопалевый. Субстратный мицелий светложелтый, светло-коричневый. Среда не окрашена. Овсяный агар. Рост хороший, воздушный мицелий бело-палевый. Субстратный мицелий зеленовато-коричневый. Среда не окрашена. Мясопептонный агар. Рост плохой, воздушный мицелий скудный, беловато серо-палевый. Среда не окрашена. Крахмальный агар с неорганическими солями. Рост хороший, воздушный мицелий палевый, бело-палевый. Субстратный мицелий желто-коричневый. Среда не окрашена. Аспарагиновый агар с глицерином. Рост хороший, воздушный мицелий белопалевый, темно-палевый. Субстратный мицелий желто-коричневый. Среда не окрашена. Пептонный агар с дрожжевым экстрактом и железом. Рост хороший, возду)ный мицелий белый, бело-палевый. Субстратный мицелий желто-коричневый, светло-желтый. Среда не окрашена. Агар с тирозином. Рост хороший, воздушный мицелий белопалевый. Субстратный мицелий светло-коричневый, коричневый. Среда не окрашена. Штамм относится к Actimomyces spheroides и к Streptomyces spheroides. Штамм образует в основном внеклеточный фермент, что значительно облегчает его выделение. Высокая продуктивность штамма стабильна при длительном хранении культуры на фибриновом агаре, содержащем, г/л: фибрин 5-10; однозамещенный фосфат калия 1-3; сернокислый магний -6; сернокислый цинк 0,005-0,01; сернокислое железо 0,015 0«02; агар 10-20, при комнатной температуре в виде спор. При глубинном культивировании на соевой среде рост штамма в виде гомогенной массы. На синтетической среде, содержащей, г/л: глюкозу 70; цитрат натрия А ,8;,сернокислый магний 5,75; сернокислый аммоний 1,25; однозамещенный фосфат калия 2,0; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо 0,02, рост штамма в виде гомогенной массы или мелких шариков. Культуральная жидкость, отделенная от мицелия имеет коричневую окраску и характерный запах. Физиолого-биохимические признаки.

310101

Оптимальная температура роста 2628 0.

Отношение к углеводам. Хорошо усваивает глюкозу, ксилозу, фруктозу, арабинозу. Не усваивает сахарозу, рафи- 5 нозу, рамнозу.

Отношение к спиртам. Усваивает маннит, инозит.

Разжижает желатину, молоко пептонизирует без свертывания, крахмал не, ю

27

гидролизует. Гидролизует фибрин, фибриноген, плазму. Тирозиназа отрицательная, меланоизов не образует, нитраты восстанавливает, на клетчатке не растет. Образует антибиотик новобиоцин,

В таблице дана фибринолитимеская активность фермента в культуральной жидкости и фибринолитическая активность препаратов предлагаемого, известного и исходного штаммов.

Штам актиномицетов Actinomyces spheroides М8-2 (Коллекция Центрального музея промышленных культур микроорганизмов ВНИИгеиетика, коллекционный номер ЦМПМ S-573) продуцент тромболитических ферментов, специфичных к фибрину

Предлагаемый (Actinomyces spheroides М8-2)

Известный (Actinom. thermo.vulgaris N-55)

Исходный (Actinomyces spheroides 35) Как видно из таблицы штамм Actinomyces spheroides М8-2 отличается от известного и исходного штаммов высокой фибринолитической активностью. Фибринолитическую активность определя ют методом Astrup. Mullertz. Продолжи тельность инкубации пластинок фибрина 3 ч при 38С. Тромболитическую активность определяют методом. Броцкой С.З. и Имшенецкого А.А. по скорос ти лизиса тромба in vitro. Культураль ная жидкость Actinomyces spheroides М8-2 растворяет тромбы крови за 30 мин 10 мкг препарата растворяет тромб за 1 ч. Величина казеинолитической активности в культуральной жид кости составляет 50-500 ПЕ/мл и 500600 ПЕ/мг препарата. Казеинолитическую активность определяют методом Ансона.. Пример Г. Актиномицет Actino myces spheroides М8-2 выращивают на скошенной агазированной среде, содержащей, г/л: фибрин 10; однозамещенный фосфат калия 3; сернокислый магний 6; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо 0,02; агар 20, при в те3500- 000

10500-11000

35ПО-5500

1900

2000-2500

70C чение 5 дней. Затем культуру актиномицета с одной пробирки переносят в 200 мл известной питательной среды, содержащей, г/л: соевую муку 20; сернокислый аммоний 3; хлористый натрий 2,5; однозамещенный фосфат калия 0,75; углекислый кальций 3;для выращивания посевного материала. Посевной материал выращивают на качалках (180-200 об/мин j в колбах емкостью 750 мл с 200 мл среды в каждой в течение 72 ч при 28°С. Затем посевной материал в количестве 5% вносят в синтетическую среду известного состава, содержащую, г/л: глюкозу 70; цитрат натрия А,8; сернокислый магний 5,75; сернокислый аммоний 1,25; однозамещенный фосфат калия 2,0; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо 0,02, и выращивают тем же способом в течение 3 сут при 28 С. По истечении указанного времени культуральная жидкость содержит 400 усл. ед/мл и 450-500 ПЕ/мл. Время растворения тромба 30 мин. Культуральная жидкость отделя1ется от мицелия при помощи бумажных фильт ров, Фибринолитический препарат осаж51010127«

дают из фильтрата сернокислым аммо- 1100 усл. ед./мг препарата и удельной нием при насыщении 0,6-0,8. Полу- казеинолитической активностью 500ченный препарат обладает удельной 600 ПЕ/мг препарата. 10 мкг препарата фибринолитической активностью 10500- растворяет тромб за 1 ч.