Способ получения ферритинспецифичных антител Советский патент 1991 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к иммунохимии,а именно к способу получения антител, специфичных к ферритину.

Целью изобретения является повышение стабильности антител, что позволяет их использовать D прикладной иммунобиотехнологии и в медицинском иммунохимическом микролнализе.

Поставленная цель достигается с ромощью предварительной инкубации анти сыворотки к ферритину с лизином, ковалентно связанным с сефарозой, и аффинной хроматографии на иммобилизованном антигене, включающей удаление балластных белков буферами с нейтральным значением рН и последующую кислотную элюцию целевого продукта,

Пример 1.Получение ферритинспецифичных антител предлагасмьгм способом.

3150

Jl M получг ния аффинного адсорбсн- T;I (1ч-ГГ1 тя солеаеикн человека иммобилизуют и,я СНВг-сефлро:1е. «В, ии- кубирул CNBr-сефароэу R с фаррити- ним 3 ч при комнат)iofi температуре и рН 8,3. Концентрация иммобилизованного фсрритинп состапляет 7- 10 мг/мл уплотненного геля.

Сыпоротку крови кролика, содержа- игую антитела к селезеночному феррити ну челогзека, получают путем иммутш- эации кролика 1 мл растнора, состоящего из смеси 0,5 мл адъюпаита Фрейн да и 0,5 мл физиологического раст- вора, содержащего 100 мкг ферритина из селезенки человека. Нн1 екции проводят с интерпалом н одну неделю 3 раза, затем через 3 педели осуществляют четвертую инъекцию и спустя 10 суток начинают отбор крови у животных.

Лизин-сефарозу полу1{ают, инкуби- рул и течение 2 ч при комнатной температуре 1 UI yrmoTHGHHovi активиро- ванпой сефарозы ЛВ с 0,2 г L-лизина растворенного в 1 мл 0,05 М карбонатного буфера с рН 8,9. Суспензию ли- зин-сефарозы центрифугируют 3 мин при 1500 g, осадок переводят в О,1 М натрий-фосфатный буфер с рН 7,4 и повторно осаждают. Концентрация иммобилизованного лизина составляет 180-200 мг/мл сефарозы.

К 0,5 Ш1 уплотненной лизин-сефаро зы добавляют 3 мл сыноуютки крови кролика, содержащей антитела к селезеночному ферритину человека,суспензию пе.рсметивают 20 мин при комнатной vfljuncparype, Супернатант отделя- ют путем це11Трифугироват1я суспензии при 1500 g в течение 3 мин, затем смешивают его с 1 мл уплотненной фер ритипсефарозы и добавляют 3 нп буфера, свдержаи1его 0,05 М трис-НС1 и 0,2 М хлористого натрия, рИ 8,0. После перемешивания в течение 1,5 ч при комнатной температуре осадок ферри- тнп-сефарозы отделяют центрифугнрсва Ш1ем при 1500 g п течение и промывают последовательно 20 объема- ми каждого из следующих растворов: п) 0,05 М трис-MCl, рИ 8,0 (буфер А), содержащий 0,2 Н к-чористый натрий,

б) буфер А, .:и.п.(-. ржа|;гип 1 М хлористый натрий,

-в) буфер А, соД1 рта1 Г1и 1 1 М хло- pHCTbii i натрий и 0,37. ni ;n;-20.

г) буфгр Л, содержании 0,2 М хлористый натрий.

Все проммпки и последующую элюцию проводят п 0:)ч -париа1П-е (т.е. пере мешиватчем суспензии сорбента в o6iie ме раствора) при температуре 0...2°С Осаждение ферритр(н-сефарозы проводят центрифугированием, как рписывалось вьппе. Элюцию низкоаффинных антител проводят 8 мл 0,05 М глицин-НС1 буфера, содержащего 0,2 М хлористого натрия, рН 3,0. Высокоаффинные антитела элюируют в 2 этапа 0,05 М гли- ЦИН-ИС1 буфером, рН 2,3, содержащим 0,2 М хлористый натрий (по 8 мл). рН полученного раствора доводят до 7,4 путем диализа против 0,1 М трис-IiCl буфера, содержащего 0,2 М хлористый натрий. Затем препарат антител лиофилизуют и хранят при -18 С

Получе. таким образом препарат при электрофорезе в 7Z-HOM полиакрил амидном гело характеризовался одной белковой полосой, соответствующей мол.м. приблизительно 160 кДа.

При гель-хроматографии на TSK-гел HW-60 f панучен один симметричный пик с мол.м. приблизительно 160 кДа. Гель-ф шьтра1и1я препарата на TSK-гел HW-60 f после его хранения в течение 4 месяцев при t-18 C дала один симметричный пик без появления видимого количества низкомолекулярных примесе

Получение ферритииспецифичных антител по способу-прототипу.

При электрофорезе в 7% полиакрил- амидном геле препараты содержали одн белковую полосу, соответстнуюигук) мол.м. 160 кДа.

При гель-хроматографии наоТЗК-ге- ле HW-60 f препарата антител непосредственно после их выделения получен один симметричный пик с мол.м. приблизительно 160 кДа.

Гель-хроматография препарата на TSK-геле noftie его хранения в течё- 4 месяцев показала, что в препарате сохраняется лишь около 20% белка с мол.м. 160 кДа при появлении низкомолекулярных примесей, составляющих 80% от исходного количества белка. Это доказывает нестабильность полученньк по способу-прототипу антител, что вьфажается н наксмьтении большого количест-на фрагметоп антител при исчезновении нативных иммуноглобулинов с моп.м. 160 кДа.

П p и M о p 2. Опр лелпнис антм- генсвязывлюпюй глгпсоб.чости /ifrTHT .vi, полученных предлагаемым м контролт,- иым смособом.

Полученные способом с испольяова- шем объекта 113обрете)гия и комтроль- ньг способом антитела иодируют по методу, обеспечипаюгаему наиболее; мягкие условия реакции. 1-мече- ные антитела отделяют от непрг-реаги- ровавшего Na 1 гель-хроматогрл- фией на TSK-геле HW-60 f и хранят в лиофилизопаииом РИДС при температуре -18 С. Непосредственно поапе гель-хроматографии и после 30 дней

125 т

хранения I-MG4eH iie антитела используют в иммунорадиометрическом определении ферритина. Для этого в пробирки вносят ферритин в количест- ве от 0,2 до 25 иг на пробирку,что соответствует концентрации ферритина в исходном растворе от 5 до 500 мкг/л. Затем добавляют 100 Miai ферритинспецифичных антител, меченых изотопом иод-125 (по 0,03-0,08 мкКи или 5-18 иг антител) и 100 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буфера,со- {бржащего 1% БСЛ и 0,2% азида лат- ия. После инкуба1Д1и в течение 3 ч фи комнатной температуре в пробирки добавляют 100 мкл 10%-ной (вес/объем ,:успензии иммуносорбо.нта, содержащего антитела к селезеночному ферриту, 1ммобилизованные на микрокристаллической целлюлозе, и встряхивают 1 ч |ри комнатной температуре. .Затем сус лензию центрифугируют 15 мин при 2000 g, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осаж- (ают. В полученных осадках определяют скорость счета радионуклида , отражающую количество связанных с иммуносорбентом комплексов })ерритина со специфическими антите- лами. Использование предлагаемого способа позволяет получать антитела, антигенсвязывающие свойства которых не изменяются за период хранения 30. суток. В то же время получение антител контрольным способом дает антитела,антигенсвязывающие свойства которых за этот же промежуток времеин существенно снижаются: уменьшаются значения . Отношение связанной с сорбентом радиоактивности к общей радиоактивности при концентрации ферритина 500 мкг/л снижается с 63 до 43%, различия величины В/Т в

;;n,i::.i ьч| - :.. ;;:; : 23П-Ч 0 г;к--/ V 41

и станс тгс. я ).(з

20 5 о Q с

5

0

П j; и I- I р . 1 l;;i- , .1: |, ч ; 1 ;i (ЯЧ,;мр ;1(м i:ii(i,, i 4i i .-п; , ii- тирогзл прп 1 ;:.. .ч ч MI-, ел .

Ио/цчрог- ,- Hir.ri i K. ir г пиг; 11 1 . p.pif мере 2, и np;4iif r:,iiri;i : г т i -М - г cin. -. матогр 1Ф1П1 на ТЯК-т- ц.- I . - it t itpo- парлт фяр-ги 1 ИНГ.II. ivliir(. -i м i ,

ЦОЛучеННЬ Х ГК- С ЬЧ-и; :-,- ЦГ Т -Т-ЦП V , его KpiMi т .чи; .чр Л11яом при с Г т(, i i диег pc ;pOMaToi p i t ip i:iT и; .: 1г:: HW-60f. PlaTfjN; гголуч мш ю фракции попользуют и КЯЧеСТ С троне (11 и 1 ММУнopaдцo eтI) (лци/те фср- ритииа. Для п прпОир Л1 .чцо- сят , И1 Г ко.пичг-стнг; ,. : )1г па

пробирку, что СОПТГЧ. Т i л-иутг KOIMU4Iтрапми ферр;;тг иа и .MC:;(UI :- pac-Tiui- ре 500 . л 1а.л. ;ьг; 100 мл фракций, получен):.1.Ч цгс.ч , матогряфии Г1;.члтарата ф( р}П ти1;сг О- ЦИФИЧ1ГЫХ антител из рлсчрг.м ::о 0,03 мкКи на пробирку. Лалг.чгГч I c определ : т1е П), как .тнюано Б примере 2, IioлyчeF I l( п зьллю - менте отноп шие связлшкш г. cnp(5eii- том ралиоактипности к обпич : к;дио- актипности, пиесоннС Г п пр(Л)ирку (В/Т) по фракциям, покалыЕкпот отсутствие л нти гене вл з ып ai iine/i снос обнос - ти у коротких Г1ептил1 1-,:х (|)iar SiPHTOD.

Пример 4. 1 с11ольясль)гие ингибиторов протеина:) ;у1я стабилизации препарата антител, по-Ч .-чйиного по способу-прототр пу.

Анти1 енсцеи:ифичнме антитела получают с помощью способл-црототипа. После доведеш1я рН до 7,А к диализо- ванному препарату, дагошему при гель- хроматографии на TSK-гелс НЬ -бО f Один симметричней пик, добавляют ингибиторы протеиназ; фетшметилсуль- фонилфторид в конечной концентрации 0,5 мМ, -a я нoкaпpoиoвyю кислоту в конечной концентрации 5 мМ, ЭДТА в конечной ко)щентрации 20 r-iM. Затем препарат хранят при . Полученные данные показывают, что использование таких ингибиторов протеиназ, как феиилметилсульфотшфторид, F. -ами- нокапроновая кислота, ЭДТЛ, не позволяет достичь цели изобретения - получить стабилизирован {ыГ1 препарат антигенспецифичньгх антител, лишенный протеолитической фр меитации нативных антител. Короткие пептид- ные фрагменты антител не обладают (как было показано в примере 3) аМ- тигенсвяэывающей активностью и являются балластным материалом. В то же время пред/тачаемый способ 0 сравнении с прототипом позволяет предохранить получаемые ферритийспе цифичные антитела от деструкции в процессе хранения.

Формула изобретений

Способ гтолученЯя ферритинспе1Ш фичных антител путем проведения хроматографии иммунной сыворотки не ферритине ковалентнр связанном с сефарозой, (Отличающийся тем, что, с целью повышения стабиль кости целевого продукта, перед хроматографией иммунную сыворотку обрабатывают лизин-сёфароэой.

Изобретение относится к практической иммунохимии и иммунобиотех- нологии и может быть использовано в медицинском иммунохимическом микроанализе. Цель изобретения - повышение стабильности целевого продукта. Поставленная цель достигается способом, включающим предварительное отделение протеиназ инкубапд1ен сыворотки крови иммунизированных животных с лизином, ковалентно связанным с активированной эпихлоргидрином се- фарозой 4В, инкубацию супернатанта, полученного после отделения лизин- сефарозы, с антигеном, ковалентно связанным с BrCN-aктиDИpoвaнIioй ссфа- розой 4В, отмывку балластных белков буферными растворами нейтральных значений рН при варьировании ионной силы (хлористый натрий 0,2-1 М) и с добавлением детергента (0,3% твин-20) и элюцию антигенспещ фичньгх антител растворами с кислыми значега ями рН (рН 3 - элюция антител низкой аффинности, рН 2,3 - элюция высокоаффинных антител). Применение способа позволяет полностью исключить деструкцию препаратов ферритинспецифичных антител в процессе 30-дневного хранения, в то время как в препарате, полученном по способу-прототипу, до 80% антител в процессе хранения раз- рушается. г (Л СП о СП