Способ получения ферритин-специфических антител Советский патент 1992 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицинскому микроанализу и может быть использовано в клинической биохимии, биотехнологии и медицине для диагностики ряда заболеваний гематолбгичес- кого и онкологического профилей.

Целью изобретения является улучшение чистоты целевого продукта.

Способ получения ферритин-специЬи- ческих антител заключается в том, что препарат ферритин-специфических антител, получаеьтый с помощью кислотной элюции с ферритин-сефарозы, очищают

от продуктов деструкции ферритина с помощью дополнительной хроматографии на гранулированном полиакриламидиом носителе (например, на биогелё Р япи акрилексе). роматогрлфию на полиак- риламидном носителе проводят, присыпая расчетное количество сухого гранулированного носителя в раствор фрр- ритин-специфических литител, что приводит к быстрому набухлнию гранул геля и прочной пдсорбцин продуктов деструкции ферритина на млтрипе поли- акрипамидного полимег1л, п то премя

СЛ

о

Од

сд

о

00

как форрити11-1;пецифические антитела в данных условиях остаются несвяяан- нь1ми с матрицей пслиакрилпмидного геля. Кроме того, с помощью биогеля удается сконцентрировать препарат антител п 3-6 pan, что также весьма существенно для их последующего использования в количественном иммуно- метрическом анализе.

Пример 1. Получение ферри- тин-специфических антител заявляемым способом.

Для получения аффинного адсорбента ферритина селезенки человека билизуют на С В-сефарозе iB стандартным методом, инкубируя С В-сефарозу 4В с ферритином 3 ч при комнатной температуре и рН 8,3. Коицеитраиия им юбилизованного ферритина составля ВТ 7-10 мг/мл уплотненного геля. Сыворотку крови кролика, содержащую антитела к селезеночному ферритину человека, получают путем иммунизации кролика 1 мл раствора, состоящего из смеси 0,5 мл адьюванта Фрейнда и 0,5 МП физиологического раствора, содержащего 100 мкг ферритина из селезенки человека. Инъекции проводят с интервалом в одну неделю 3 раза, за- тем через 3 недели осуществляют четвертую инъекцию и спустя 10 сут начинают отбор KpoBrt у животных. Полученую антисьгеоротку (3 мл) смешивают с мл уплотненной ферритик-сефарозы и добавляют 3 мл буфера, содержащего 0,05м трис-НС1 и 0,2М хлористого натрия, рН 8,0. После перемешивания в течение 1,5 ч при комнатной температуре осадок ферритин-сефарозы отделя ют центрифугированием при 1500 g в течение 3 мин и промывают последовательно 20 объемами каждого из следу- кпцих растворов:

0,ОЗМ ТРИС-НС1, рН 8,0 (буфер А), содержащий 0,2М хлористый натрий;

буфер А, содержащий 1М хлористый натрий;

буфер А, содержаватй М хло4)истый натрий и 0,3Z твин-20;

буфер А, содержащий 0,2М хлорис- пЛ натрий.

Все промывки и последующую элюцию проводят в бэч-варианте, т.е. перемешиванием суспензии сорбента в объеме раствора. Осаждение ферритии-се- фарозы проводят центрифугиропанием, как описывалось выше. Элюцию низкоаффинных антител проводят 8 мл 0,05М

0

5 0 25 30 до

45

35

50

55

глиии11-11С буфера, содержащего 0,2И хлористый иатр1й, рП 3,0. Высокоаффинные антитела элюируют в 2 этапа 0,05М ГЛИЦИН-НС1 буфером, содержшцим 0,2М хлористый натрий, рИ 2,3 (по 3 мл).

К раствору высокоаффинных антител (16 мл) присыпают 500 мг биогеля Р (200-400 мещ), перемешивают 5 мин при О - и центрифугируют 15 мин при 7000 g..Супернатант с концентрацией белка 200-800 NtKr/мл собирают, доводят рН до 7,6-8,0 и используют как препарат высокоафф1шных фер- ритин-спецйфичкых антител.

Получение ферритин-специфических антител с помощью известного способа проводят по npmiepy 1 до стадии киг.- лотной элюции. Элюцию проводят с помощью раствора с рП 3,0 по примеру I и на этом заканчивают процедуру получения антител.

П р и м е р 2. Проведение количественного иммунорадиометрического определения ферритина с помоиа ю препарата ферритин-специфических антител, .полученных заявляемым способом,

В пробирку вносят 250 мкл раствора подогена (4 мкг) в хлороформе и хлороформ выпаривают в токе аргона. Затем п ту же прббирку вносят f,5 - 2 мКи Na в объеме 40 мкл 0,2М трис-HCl, рИ 7,5 и 100 мкг ферритин- специфичных антител в объеме 200 мкл О,1М трис-ИС1, рН 8,0, содержащего О, 1М хлористьв натрий. Смесь инкубируют 10 мин при комнатной температуре, после чего Т меченые антитела отделяют от непрореагировавшего 1 гель-кроматографией на TSK-геле HW- 60 f.

-меченые ферритин-специфические антитела используют в им ryнopaдиoмeт- рическом определении ферритина. Для этого в проб1фки вйосят ферритшс в количества 0,2 - 25 нг на пробирку, что соответствует концентрации ферритина в исходном растворе 5 -500мкг/л Затем добавляют 100 мкл ферритин-специфических антител,меченых изотопом l (по 0,03.-0,ОВ мкКи или 5-18 нг антител) и 100 мкл 0,05М натрий-Фосфатного буфера, содержащего 1% бычьего, сывороточного альбумина и 0,02 0,02% азида натрия. После инкубации в течение 3 ч Т1ри 18 - 25 С или I ч при 37 С в пробирки дс баплпют ЮО.-шл 10%-ной (мае./об.) суспензии HMfryHOсорбента, содер.пи1его лптителл к селезеночному ферритмну, иммобилиповлн- ныо на ммкрокрмстлллическом целлюлозе, и встряхивают I ч при 18 - 25 С. Затем суспензию центрифугируют 15 мин при 2000 g, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осаждают. В полученных осадках определяют скорость счета радионуклида 1, от- ю ражающую количество связанных с имму- носорбентом комплексов Ферритина со специфическими лнтителами, В свою очередь этот показатель лакономерно связан с количеством ферритина, до- 15 бавляемого с исследуемым раствором.

Количественное иммунорадиометриче- ское определение ферритина с помощью препарата ферритин-специфических антител, полученного известным способом, 20 анализ и обработку результатов проводят по примеру 2.

Улучшение качества антител, которое влечет за собой сокращение времени анализа, достигается без потери 25 его чувствительности, точности и достоверности. В большинстве из перечисленных показателей анализ с применением антител к ферритину, полученных заявляемым способом, имеет некоторые 30 преимущества.

Пример 3. Проверка качества препарата антител, полученного заявляемым и контрольным способами, в конкурентном тесте.-эс

Конкурентный тест представляет собой определение особенности препарата антител конкурировать в иммунорадио- метрической системе с l-мечеными антителами за связывание с феррити- 40

ллс

ном,1-меченые антитела, а также

иммуносорбент, используемые в имму- норадиометрической системе, получают с поьющью стандартной методики, описанной в примере 2. При проведении дз конкурентного теста в пробирки вносят по 100 мкл раствора ферритина с концентрацией 100 мкг/л. Затем добавляют 100 мкл 10%-ной (мае./об.) суспензии иммуносорб.ента и 200 мкл стан- 50 дартного буферного раствора (0,05М натрий-фосфатный буфер, содержащий 1% бычьего сьгаороточного альбумина и 0,02% азида натрия). После инкубации в течение 1,5 ч при 18-25 С и по- 55 стоянном.встряхивании суспензию центрифугируют 15 мин при 2000 g, осад- ки промьюают 2 кп дистиллированной воды и повторно осаждают. К осадкам

прибавляют 170 100 мкл рлсттшрл. содержащего 10, 1.00, 500 и 1000 iif те- cтиpye ьrx ферритин-спеииФичсских am тел, что соотпетстмует коипситрлпии ферритин-специфичпских лптитс.ч п исходном растворе О,, 1,5 и 10 мт /мл соответственно. Затем в каждую пробирку вносят ЮО мкл -меченых фор ритин-специфических антител со скоростью счета 50 тыс. имп./ми1Г и 200 мкл стандартного буфера. Суспензюо встряхивают 2 ч при комнатной температуре. ее центрифугируют 1 5 мин при 2000 g, осадки промьгаают 2 мл дистиллированной поды и повторно осаждают. В полученных осадках определяют скорость счета радионуклида , отражающую количество связан1П гх с иммуно сорбентом комплексов ферритина со

1-меченными антителами (контрольна проба), а также способность исследуемых препаратов антител конкурироват с 1-мечснными антителами за связывание с ферритином.

Снихение связатюй с иммуносорбен том радиоактив}юсти при увеличении в среде инкубации концентрации антител полученных заявляемым способом, свидетельствует о конкуренции немеченых антиле с мечеными за связ1,1В1ППие с ферритином, который в свою очередь биоспецифически связан с иммобилизованными на целлюлозе антителаьш. Степень снижения связанной с Иммупосор- бентом радиоактивности при увеличении концентрации конкурирующих антител отражает аффтгность антител.

Таким образом, данный пример зьтает, что заявляемьп) способ позволяет удёхлить из препарата фегуэнтют- специфических антител продукты деструкции ферритина, которые присутствуют, как следует из примера, в препарате, полученном по известному способу.

Анализ экспериментальных примера 3 показывает, что положитель- ный эффект заявляемого способа в сравнении с прототипом заключается в улучшении качества антител, что приводит к уменьшению прсмени анализа при сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности. Формула изобретения

Способ получения фсрритип-спецмфи- ческих антител путем проведения хро7- «5035088

матографии иммунной еыворотки на фер-вого продукта, после хроматографии

ритиие, ковалентно связанной с сефа-осуществляют адсорбционную хроматороэой, отличаюшийся тем,графио на гранулированном полиакрнл

что, с целью повыпения чистоты целе- амидном носителе.

Изобретение относится к медицинскому микроанализу, а именно к имму- норадиометрическому определению фер- ритина, и может быть использовано в клинической биохимии, биотехнологии и медицине для диагностики ряда заболеваний гематологического и онкологического профилей. Цель - улучшение качества пол чаемьгх ферритин-специ2 фических антител,Поставленная цель достигается способом, включающим инкубацию сыворотки крови иммунизированных кроликов с ферритином, кова- лентно связанным с Г)ГСН-активирован- ной сефарозой 4В, отмьшку балластных белков буферными растворами нейтральных рН при варьировании ионной силы (NaCl 0,2-1 М) и с добавлением детергента (0,3%-ный твин-20), элюцию фер- ритин-специфических антител растворами с кисльми значениями (рН 3 - элюцип антител низкой аффинности, рН 2,3 - элюция высокоаффинных антител) и адсорбционную хроматогрлфюо препарата антител на гранулированном нолиакрил- амлдном носителе (биогель, акрнлекс позволяющую удалить примесные продукты кислотной деструкции ферритина. В результате достигается уменьшение времени анализа при сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности. С