Способ определения активности цитолитических ферментов Советский патент 1962 года по МПК C12Q1/40 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Заявлено 12 декабря 1961 г. за № 755319/28-13

в Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Опубликовано в «Бюллетене изобретений № 20 за 1962 г.

Известно, что цитолитические ферменты содержатся в прорастающих зернах, в значительных количествах продуцируются различными грибными культурами и представляют собой комплекс ферментов. Определение активности цитолитических ферментов затрудняется отсутствием субстрата, по разрушению которого можно было бы судить об iiKTHBHOCTH основного компонента комплекса ферментов - цитазы.

Предлагается способ, позволяющий объективно определять активность цитолитических ферментов, что дает возможность уточнить приемы технологии при производстве спирта, особенно при переработке несоложенного сырья.

Особенность способа состоит в том, что за единицу активности цитазы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40° образует из соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы. За единицу активности гемицеллюлозы принимают количество -грибной культурь или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40° образует из пентозанов соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы.

Способ может быт осуществлен следующим путем.

Общая активность цитазы. В 10 жг субстрата (ячменя) вносят 2 мл грибной вытяжки (1:2) 7Q мл дистиллированной воды. Для контроля на такое же количество субстрата вносят 2 ял инактивированной вытяжки. Определение проводят в стаканах заторного аппарата при работе мещалок в течение 2 час при температуре 40°. По окончании цитолиза содержимое стаканов доводят до 200 г, отфильтровывают и

№ 150808

в фильтрах определяют редуцирующие вещества по Бертрану. Разница в содержании редуцирующих веществ между опытом и контролем соответствует количеству редуцирующих веществ, которое образуется из клеточных стенок ячменя под действием цитолитических ферментов,

Активность гемицеллюлозы. В коническую колбу емкостью 100 мл. вносят 0,7 г субстрата (ячменя), 10 мл фосфатно-цитратпого буфера рН 4,6 и 10 жл дистиллированной воды. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 45° в течение 15 мин. Затем в смесь вносят вытяжку из грибпой культуры, полученную настаиванием ее с 2 ч. дистиллированной воды в течение 5 час при температуре 20°, доводят объем реакционной смеси до 25 мл, колбу закрывают резиновой пробкой и выдерживают в течение 2 час при температуре 40°. По окончании цитолиза действие фермента прекращают 20-минутным кипячением на водяной бане. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр и в фильтрате определяют количество редуцирующих веществ по Бертра пу.

Так как сам субстрат не содержит редуцирующих веществ, а гемицеллюлозы с растворами Фелинга при определении редуцирующих веществ по Бертрану дают гели, затрудняющие этоопределение, то контроль с инактивированной грибной вытяжкой не ставится, а из общего количества редуцирующих веществ, определенных в опыте, вычитаются редуцирующие вещества, содержащиеся в грибпой вытяжке.

Активность цитолитических ферментов выражается в единицах. За единицу цитазы гемицеллюлозы принимают то количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40° образует в первом случае (активность цитазы) из субстрата, а во втором случае (активность гемицеллюлозы) из пентозанов субстрата 10 мг ксилозы (или глюкозы).

Пример расчета активности гемицеллюлозы. В 0,7 г субстрата внесено 0,25 мл грибной вытяжки, 10 мл буфера и 14,75 мл дистиллированной воды.

При определении редуцирующих веществ в реакционной смеси после цитолиза на 10 мл ее фильтрата затрачено 4,3 мл КМпО4 (Т 10,14), что соответствует 55,62 мг ксилозы во всей реакционной массе.

Определив, что в 0,25 жл грибной вытяжки, взятой для анализа,, содержится 2,0 мг ксилозы, находят фактическое количество редуцирующих веществ, образующихся из субстрата под действием гемицеллюлозы: 55,62-2,0 53,62 мл ксилозы.

Так как 0,25 мл грибной вытяжки (1:2) соответствует 0,125 г грибной культуры, то находят, что под действием 1 г культуры из субстрата образуется:

0,125 грибпой культуры - 53,62 мг ксилозы

1 г грибной культуры - X

X 428,9 мг ксилозы, что в пересчете от пентозанов гемицеллюлознога субстрата составляет 1082,5 мг ксилозы, а активность гемицеллюлозы данной грибной культуры равна 108,25 единицам.

Предмет изобретения

1. Способ определения активности цитолитических ферментов, отличающийся тем, что, с целью объективного определения активности цитолитических ферментов, за единицу активности цитазы прини-мают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40° образует из соответствующего количества субстрата 10 мг ксилозы или глюкозы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что за единицу активности гемицеллюлозы принимают количество грибной культуры или ферментного препарата, или солода, которое в течение 2 час при температуре 40° образует из пентозанов соответствующего количества субстратов 10 мг ксилозы или глюкозы.

№ 15080S