Способ получения амида Советский патент 1989 года по МПК C12N9/06 

1

(21)4011809/30-13

(22)07.01.86

(31)452/85

(32)08.01.83

(33)JP

(46) 30.09.89.БНШ. ( 36

(73) Нитто Кемикал Индастриз Ко.,

Лтд (JP)

75) Итиро Ватанабе и Пасами Окумура

(JP)

(53) 631,841(088.8)

(56) Заявка Франции № 2421212,

кл. С 12 D 13/06, 1979,

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНИДЛ (57) Изобретение относится к способам получения амидов с помощью микроорганизмов, более.конкретно к способам гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Лля этого нитрилы, содержащие 2-6 атомов углерода, подвергают воздействию микроорганизма RhodocQCcus sp. S-6 FERM-BP № 687,- обладающего способностью гидратировать нитрилы с образованием соответствующих амидов в водной среде, 1 табл.

G

о

Изобретение относится к способу получения амидов с помощью микроорганизмов, более конкретно к способу гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Для этого нитрилы, содержащие 2-6 атомов углерода, подвергают воздействию микроорганизма RHODOCOCCUS SP 5-6 FERM - BP N687, обладающего способностью гидратировать нитрилы с образованием соответствующих амидов в водной среде.

Изобретение относится к способам получения амидов с помощью микроор1 а- низмов, в частности к способам гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды,

Цель изобретения - повьшение выхода целевого продукта.

Rhodococcus sp. S-6 обладает особенно высокой нитрилазной активностью, он депонирован в Исследовательском институте ферментации агенства промышленной науки и технологии министерства международной торговли и промышленности, Япония, под номером FERM-BP № 687.

Морфология, Некрупные палочки 0,5- 0,8 мкм в диаметре и 1-5 мкм в длину. На начальной стадии культивирования клетки имеют удлиненную палочкообразную форму, наблюдается нерегулярное ветвление. Затем они разламываются и расщепляются на сферические или короткие палочкообразные формы (плеомор- физм). .- Подвижность не наблюдается.

Образование спор не наблюдается.

Окрашивание по Граму положительно (+).

Устойчивость к кислотам отрицательная (-) .

Характер роста на различных культу- ральных средах (30°С).

Культура на пластинах бульона на агаре: колонии круговые, неправильные, поверхность гладкая с легким розовым оттенком.

Культура на скошенном агаре: рост хороший, поперечное сечение трапецевидное, без блеска слегка розоватая.

сл hd

4i

00 СХ)

О1

Культура на жидком бульоне: интенсивный рост во время образования пелликул, жидкость прозра чна, осадок по мере роста.

Физиологические характеристики.

Восстановление нитрата: положительно (+).

Разложение мочевины: положительно (+).

Выработка индола: отрицательно ( Гидролиз крахмала: отрицательно (-) .

Разложение желатина: отрицательно (-) .

Разложение целлюлозы: отрицательно (-) .Оксидаза: отрицательно (-).

Каталаза: положительно (+).

Потребность в свободном кислороде положительно (+).

Рост в анаэробных условиях: отрицательно (-) .

0/F тест: 0.

Рост при 37 °С

Потребность в тельно (-).

Продуцирование газа из глюкозы: отрицательно (-).

;положительно (+). витаминах: отрицаПродуцирование кислоты из глюкозы: 30 0,01 до 10 вес.% клеток и от около

положительно (+).

Химический состав клеток.

Содержит мез о-диаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу.

0,1 до 10 вес.% нитрильного соединения, при температуре от ее точки замерзания до 30°С, предпочтительно 7-9, в течение 0,5-10 ч.

Содержит жирные кислоты (n, 1), 35 , Нитрильные соединения, используемые

С ,я (F, )

18

И

С,,(10-СНз) в

качестве осв качестве субстрата, являются биологически очень токсичными и оказывают вредное воздействие на ферментную реакцию. Поэтому нитрильное соедине- ние добавляют постепенно, контролируя, чтобы концентрация нитрилов в системе предпочтительно, не превышала 2 вес.%.

40

45

новных жирных кислот.

Содержит С,, -C g-микoлoвьIe кислоты в качестве типа миколовых кислот.

Штамм S-6 определяют как бациллу, которая является грам- положительной, отрицательной по спорообразованию, аэробной, обладающей полиморфолизом и отрицательной устойчивостью к кислотам.

Этот штамм, включает в себя мезо- диаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу, (n,F), С ,g (F ) и )( 0-CU-) в виде жирных кислот и С„,-С,,,--миколовые кислоты в виде мйко3Z Ро

ловой кислоты.

На основании приведенных бактериоло- ; гических характеристик настоящий штамм ; идентифицирует как бактерию, принадле- жагцую к роду Rhodococcus.

При культивировании 1микроорганиз- мов по предлагаемому способу используют обычную культуральную среду, содержащую источник углерода (например.

55

глюкоз у, глицерин и мальтозу) ,источник азота (например,сульфат аммония и хлористый аммоний) и источники органических

питательных веществ (например,дрожжевой экстракт,пептон,мясной экстракт,соевый протеиновый гидролизат и жидкость после замачивания кукурузы (CSZ), источник неорганических питательных

веществ (например, фосфат, магний,

калий, цинк, железо и марганец) и т.д. Такое культивирование проводят в аэробных условиях при перемешивании при рН 6-8 и 20-35°С, предпочтительно 25-30°С, в течение 1-3 дней.

На практике при осуществлении способа один из штаммов, выбранный из указанных микроорганизмов, культивируют в течение 2-3 дней указанным способом, а получе п1ые культуры или клетки выделяют из культуры или обработанные клетки (неочищенные ферменты, иммобилизованные клетки и т.д.) суспендируют в воде, буфере или

физиологическом солевом растворе, а затем добавляют нитрильное соединение. Нитрильное соединение воздействует на клетки при взаимодействии с водной средой, обычно содержащей от около

0,1 до 10 вес.% нитрильного соединения, при температуре от ее точки замерзания до 30°С, предпочтительно 7-9, в течение 0,5-10 ч.

, Нитрильные соединения, используемые

, Нитрильные соединения, используемые

в качестве субстрата, являются биологически очень токсичными и оказывают вредное воздействие на ферментную реакцию. Поэтому нитрильное соедине- ние добавляют постепенно, контролируя, чтобы концентрация нитрилов в системе предпочтительно, не превышала 2 вес.%.

Если рП находится за пределами указанного интервала значений, образующийся и накапливающийся амзед далее гидролР1зуется и стабильность клеток пон1скается. Поэтому предпочтительно контролировать значение рН в интервале 7-8 путем постепенного добавления каустика (например, NaOH и КОН) или путем предпочтительного добавления к системе буфера.

Если условия реакции контролировать соответствующим образом, целевой амид можно получить и выделить из нитриль- ного соединения с конверсией приблизительно 100% и практически без образования побочных продуктов.

515

Образовавшийся амид можно выделить из реакционной смеси обычными способами, например клетки выделяют из ре- акционной смеси с помощью центрифу

ги, обработкой активированным углем или ионообменной смолой и т.д., а затем концентрируют при пониженном давлении до получения целевого амида, например акриламида.Ю

Различные нитрилы и соответствующие им амиды количественно анализи- рз-тот с помощью газовой хроматографии, а соответствующие им органические кислоты - с помощью высокоэффективной j 5 жидкостной хроматографии.

Пример 1. Штамм Rhodococcus sp. S-6 культивируют в аэробных условиях на среде (рН 7,2), содержащей вес,%: глюкоза 1, пептон 0,5J дрожже- 20 вой экстракт 0,3-, мясной экстракт 0,3, при 30°С в течение 48 ч. Образующиеся при этом клетки выделяют с помощью центрифуги и промывают 0,05 М фосфатным буфером (рИ 7,7). Эту процедуру повторяют до получения промытых клеток штамма S-6 (содержание воды 80%) .

Приготавливают смесь 0,5 вес.ч. промытых клеток и 84,5 вес.ч. 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,5), а затем

15 вес.ч. акрилонитрила добавляют по

о

частям при перемешивании при 0-3 С, контролируя условия таким образом, чтобы концентрация акрилонитрила в ре- .акционной системе не превышала 2%, т.е . не подвергая акрилонитрил реакции гидратации. Добавление акрилонитрила завершают примерно через 3 ч. Для обеспечения завершения реакции перемешивание продолжают еще в течение нескольких часов..Затем клетки выделяют с помощью центрифуги до получения прозрачного раствора. Этот

раствор содержит 20% акриламида., выход акриламида превышает 99,9%.Непрореагировавший акрилонитрил вовсе не

детектируется, а содержание побочных продуктов акриловой кислоты не превышает 0,1% (в расчете на вес акрил- амида) .

Воду отгоняют из прозрачного раствора при температуре не более 50 CJ прозрачный раствор концентрируют до осаждения кристаллов. Эти кристаллы перекристаллизовывают из метанола, до получения бесцветных пластинкообраз- ных кристаллов. Это соединение определяют как акриламид на основании

35

45

50

55

25 30 40

элементного

температуры плавления, анализа и данных ИК.

Пример 2. Промытые клетки штамма S-6 получают так же, как в пмере 1, и определяют их реакционнуто способность по отношению к различ- ньпч нитрилам в следующих условиях.

Условия реакции:

Нитрильное соеди5

0

5

5

0

5

нение,

2,5 0,05

Калийфосфатный буфер (рН 7,7), М Клетки (в виде ухргх клеток),мг 5 Температура,с 10 Время реакции,мин 10 Количество реакционного раствора, мл 10 Результаты реакции приведены в таблице.

П р и М е р 3. 100 мл культураль- ной среды, содержащей вес.%: глицерин 1; . 0,1i 0,05, 5 FeSO -7H20 0,001j соевьй белковьй гидролизат 0,5 дрожжевой экстракт (рН 7,5) 0,1, который стерилизуют и к которому добавлено 0,5% стерильного изобутиронитрила, приготавливают в 0 Эрленмейеровской склянке емкостью 500 мл. Затем добавляют 1 мл культуры типа культурального штамма, которую культивируют в течение 48 ч в такой же культуральной среде, что и в примере 1 , и культивирование ведут при вибрации при в течение 48 ч. После завершения культивирования клетки выделяют с помощью центрифуги, а затем промывают 0,05 И фосфатным 0 буфером (рН 7,7). Эту процедуру повторяют до получения промытых клеток. .Определяют активность этих клеток по образованию акриламида из акрияо- нитрила так же, как в примере 2. Полученные результаты:

Тип штамма

Rhodococcus crythro- polis IFM 155 Rhodococcus rhodoch- rous IFM 153 Arthrobacter oxydans

IFO 12138

Arthrobacter aures- cens lAl I 12340 Microbacteriura- . flavum lAM 1642

Активность при образовании акриламида, мкИ/мг ч

2,5 5,0 2.,0 2,0

7 15124888

Формула изобретен и.ящийся тем, что, с целью повышения

выхода целевого продукта, биотранс- Способ получения амида путем био- формации подвергают нитрил с 2-6 трансформации нитрила штаммом бакте- с атомами углерода, а в качестве бак- рий в буферном растворе при постоян- терии используют штамм Rhodococcus ных рН и температуре, отличаю- зр. S-6 FERM-BP № 687.

Относительное значение по отношению к акрило- нитрилу в качестве 100