Способ получения амидов Советский патент 1993 года по МПК C12P13/02 C07C231/06 

Изобретение относится к способу гидратации нитрилов с их превращением в соответствующие амиды действием нитрилгидратазы, производимой микроор- .ганизмом. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения амидов биологическим путем, характеризующемуся используемым микроорганизмом и способом образования нитрилгидратазы.

Изобретение создано на основе того от- крытия, что особый штамм рода Rhodococcus, а именно, штамм 1-1 вида rhodochrous не образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион железа, но образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион кобальта, и образующая нитрилгидратаза может использовать в качестве субстрата ароматический нитрил с его превращением в амид.

Соответственно г.пособ получения амидов настоящего изобретения является способом получения амидов биологическим путем, в котором нитрил гидратируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом, и

способ характеризуется тем, что указанную нитрилгидратазу получают культивированием микроорганизма вида Phodococcus rhodochrous в присутствии ионов кобальта.

Согласно настоящему изобретению несмотря на нулевую активность нитрилгидратазы в культурной среде, содержащей ион железа, в культуральной среде, содержащей ион кобальта, активность будет расти. Можно считать совершенно неожиданным, то, что деятельность нитрилгидратазы указанного специфичного микроорганизма будет решающим образом зависеть от типа присутствующего в культурной среде иона металла.

Более того, в соответствии с настоящим . изобретением можно успешно проводить гидратацию ароматического нитрила. Поло- . жительный эффект настоящего изобретения определяется важностью никотинамида - продукта гидратации 3-цианопиридина, в качестве исходного продукта в синтезе витамина или пиразинамида - продукта гидратации цианопиразина, используемого в качестве туберкулостата.

ел С

00

СО 00

N

с

Сл)

1. Некоторые общие положения способа получения амида биологическим путем

Изобретение относится к способу гидратации нитрила с превращением его в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образуемой микроорганизмом, и в основе способа лежит культивирование микроорганизма, индуцирование нитрилгидратазы и действие полученной в результате нитрилгидратазы на нитрил в качестве субстрата.

Указанные стадии сами по себе известны в виде отдельных операций, и они в соответствующей форме используются в настоящем изобретении. Выражение нит- рилгидратазу получают культивированием микроорганизма в присутствии иона кобальта имеет в виду индуцирование нитрилгидратазы как естественную предпосылку.

Преамбула настоящего изобретения, звучащая как: способ гидратации нитрила с его превращением в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом, включает любые оформления или вариации, приводящие к действию нитрилгидратазы на нитрил. В качестве одного из примеров такого оформления можно указать способ выделения образованного микроорганизмом фермента и последующее его использование в виде ферментивного препарата. Такой путь использования нитрилгидратазы при котором фермент используют в виде ферментивного препарата, следует понимать, как попадающий в категорию способа получения биологическим путем настоящего изобретения.

2. Подробности реакции гидратации

1) Микроорганизм

Применяемый в настоящем изобретении микроорганизм относится к виду Rhodococcus rhodochrous.

Представительным штаммом этого вида является штамм 1-1.

Характеристика штамма 1-1:

(1) Происхождение и депозитирование Штамм 1-1 выделен из почвы, отобранной в Сакио-ку, Киото, Япония, и депозити- рован как международный депозит (в соответствии с Будапештским Соглашением о международном признании депозитов микроорганизмов для целей патентной практики) в исследовательском Институте ферментации, Япония,, Агентство по промышленным разработкам и технологии под регистрационным номером PERM BP-1478.

(2) Бактериологические свойства

(а) Морфология

(1) Форма и размер клеток - 0,9-1,Qu х 3-10/.

(2) Наличие полиморфизма в клетках - Клетки имеют форму 5длинных стержней из

начальных этапах культивирования, рост с изменением формы и затем деление на ко- 10роткие бациллы.

(3) Подвижность - Отсутствие.

(4) Присутствие спор - Отсутствие.

(5) Окраска по Граму - Положительная.

(6) Кислотоустойчи- .

5

вость Отрицательная.

(7) Гетерофильные

гранулоциты -Обнаруживаются.

(о) Состояния роста в различных культурных средах (30°С)

(1) Бульоная культура на пластине агара - Окружность диаметром 1 мм (48 часов), неравномерная и гладкая, поверхность

.довольно сухая, плос- 5 кая, непрозрачная,

бледно-оранжевая-розовая окраска.

(2) Бульоная культура на скошенном агаре - Нити с довольно су- 0хой гладкой поверхностью, в сечении слегка проступающая довольно сухая, бледно-оранжевая-розоваяс окраска.

(3) Бульоная жидкая

культура -Цветущий рост, обра- i зование бактериальной клеточной мембраны, умеренное помутнение, образование осадка по мере роста.

(4) Бульоная культура на столбике желатина - Рост мелкими час- 5тицами на поверхности, в форме конуса в части столбика, но не в его нихсней части, разжижение желатина 0 - не наблюдается.

(5) Лакмусовое молоко -Без изменений, (с) Физиологические свойства

е (1) Восстановление

нитратов -Положительно.

(2) Денитрификация - Отрицательно.

(3)МЯ-тест-Отрицательно.

(4) VP-тест -Отрицательно.

(5) Образование ин0

дола -Положительно.

(6) Образование сероводорода -Положительно.

(7) Гидролиз крахмала -Отрицательно.

(8) Усвоение лимонной кислоты: Культурная среда Ко- кура -Отрицательно. Среда Кристансена - Положительно

(9) Усвоение неорганического ика азота:

нитрат -Положительно, аммониевая соль - Положительно.

(10) Образование красителя -Отрицательно.

(11)Уреаза -Положит

(12) Оксидаза -Отрицательно.

(13) Каталаза -Положительно.

(14) Гидролиз целлюлозы -Отрицательно.

(15) Условия роста рН 5-10.Температура 10

(16).Отношение к кислороду -Аэробны.

(17) Разложение ти.розина 7Положительно.

(18) Разложение аденина -Положительно.

(19) Фосфотаза - Положительно.

(20) Гидролиз Твин 80 (21)0-Р-тест- 1 (22) Теплостойкость (в 10% снятом молоке, 72°С, 15 минут) - Отсутствие.

(23) Образование кислоты и газхаров:

Положительно. Отрицательно

Кислота

Газ

L-арабиноза D- ксилоза D-манноза D - глюкоза+ D - фруктоза + . Мальтоза + Сахар f Лактоза Трегалоза D - Сорбит + D - Маннит + Глицерин + +: положительно: -: отрицательно. (24) Выращивание в единичном источике углерода: Инозит

Мальтоза+ D-Маннит + Рамноза

D-Сорбит+ м-Гидроксибензойная кислота Адипат натрия + Бензоэт натрия +

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

t + i

(+)

(О

Цитрат натрия

Лэктат натрия

Тестотетрон

L-тирозин

Глицерин (1 мае. %/об.)

Трегалоза

п-П;дроксибензойная

кислота (1 мае. %/об.)+

+: положительно; -: отрицательно: (+) слабо положительно. (25) Жирные кислоты и анализ клеточных стенок -Присутствие ненасыщенных и насыщенных жирных кислот нормального строения и туберкулостеа- риноаой кислоты. ТГП миколевой кислоты дает од.чо пя -.и.

В результате классификации вышеприведенных бактериологических свойств в свете Bergy s manuac of Systematic Bacteriology), выясняется, что штамм 1-1 является аэробной, грам-по ложительмгн слабо кислотоустойчивой, каталаз-положч тельной и негенерирующей эндоспор 6. циллой, которая не внедряет жгутиков. На начальных стадиях роста имеет форму удпи- ненной палочки подобно мицелию, с ветвлением и затем делится на короткие палочки. Таким образом, признают ее принадлежность к бактериям типа Nocardia.

Анализ состава жирных кислот показывает, что бактерия содержит насыаиэнные и ненасыщенные нормальные кислоты, в том числе туберкулостеариновую кислоту. ТСХ- анализ миколевой кислоты дает одно пятно с тем же значением Rf, что и для стандартной бактерии Rhodococcus hodochrous (IF03338), что отличает ее от рода Mycobacterium. Она также отличается от рода Nocardia составом (числом атомов углерода) миколевой кислоты. Из рассмотрения других биохимических свойств следует, что бактерия является Phodococcus rhodochrous.

Кроме штамма 1-1. открытого создателями изобретения, и который по их мнению является наиболее предпочтительным для вида R.rhodochrous, нижеперечисленные штаммы являются примерами других штаммов R.rhodochrous, которые могут быть использованы в настоящем изобретении и которые можно получить вуказанных хранилищах:

()IFO 3338,

(11}1СМ2157.

(III) ICM 3302,

(IV)NCIB9703,

(V)NCIB 11277

Указанные штаммы депозитированы в опздующих хранилищах

IFO - Институт ферментации, Осака, Япония, luso Honmachl 2 chome, Osaka - shi, 532, Япония; .

ISM - Коллекция микроорганизмов Японии, Рикен (Институт физико-химических исследований), Wako-shl, Saitama, 351-01, Япония;

NCIB - Национальная коллекция промышленных и морских бактерий, Абердин, Шотландия, Великобритания.

Микроорганизмы имеют тенденцию к мутациям. В связи с этим нет необходимости подчеркивать, что бактерия, даже являясь мутантом исходной бактерии, такой как штамм 1-1, может быть использована в способе настоящего изобретения, если только продукты культивирования мутанта образуют в присутствии ионов кобальта нитрил- гидратазу.

2) Субстрат (нитрил)

Нитрилы, используемые в качестве субстрата нитрилгидратазы, образованной вышеописанным микроорганизмом, относятся к ароматическим и алифатическим мононитрилам или динитрилом, особенно мононитрилам..

Нитрилы, для которых наилучшим образом используются особенности настоящего изобретения, являются ароматическими нитрилами, в частности, нитрилы с 4-10 атомами углерода, образующими ароматический цикл. Несколько типичных примеров ароматических нитрилов представлены соединениями нижеследующих формул ()-(VI) N

-CN 0)

@н

Типичными для них являются 5-, 3- и 2-цианопиридины: QJO

R1-fObR2 (II) (||)

где R1 и R2 соответственно представляют Н, СНз, ОН, ОСНз, Cl, F, CN, NH2 или N02.

К их числу относятся бензнитрил, о-, м- и п-хлор или о-, м- и п-фтор- бензнитрилы, о- и м-нитробемзнитрилы, п-аминобензнит- рил, о-, м- и п-толунитрилы, 4-цианофенол, анизонитрил, фталонитрил, изофталонит- рил, терефталонитрил. 2,6-дихлорбензнит- рили 2,4-дихлорбензнитрил, 2,6-дифторбензонитрил.

©ЗЬ™ „,„

0

Формуле (III) соответствуют тонитрилы.

X (CB-CN(IV)

где X представляет S или 0.

Типичным представителем соединений формулы (IV) является 2-тиофенкарбонит- рил и 2-фуронитрил.

NH NC -foYdl(V)

Типичным примером (V) является 5-циа- ноиндол. 15(Ч

(p)-CN N

(VI)

Типичным примером VI является цианопиразин.

Другая группа нитрилов, составляющих объект настоящего изобретения, включает предпочтительно алифатические нитрилы, более предпочтительно моно- или динитрилы с 2-6 атомами углерода, но наиболее предпочтительно-мононитрилы. С точки зрения полезности получаемых амидов типичным примером являемся акрилонитрил, образующийся с хорошими выходами.

Ясно, без особого обсуждения, что амидами, соответствующими указанным нитрилам, являются амиды, полученные превращением СN-группы нитрилов в CONH2-rpynny. В случае динмтрилов следует рассматривать вариант получения соответствующих амидов превращением по меньшей мере одной CN-грулпы в CONH2- группу.

3) Культивирование-продуцирование

нитрилгидратазы.

Культивирование микроорганизма види Rhodococcus rhodochrous может быть осуществлено в любых приемлемых условиях, но в присутствии в культурной среде ионов

кобальта. Может оказаться общим правилом введением в культурную среду индуктора фермента, подробно описанного ниже, с целью вызвать накопление нитрилгидратазы в бактериальных клетках.

(1) Базальная среда.

Примеры приемлемых культурных сред иллюстрируются следующим образом. Для специалиста не составит труда изменение количеств-(а) компонента-(ов), приведённых

ниже, замена одного компонента другим и исключение некоторых компонентоз-(а) или добавление других компонентов-(э). (1) Культурная среда А КомпонентКоличество

(в 1 л среды)

Витаминная смесь 1 0,1мл

К2НР0413,4 г

КН2Р046,5 г

NaCI1 г

MgS04-7H200,2 г

Дистиллированная

водаОстальное (рН 7)

1 Состав

Биотип2 мкг

Пантотенат кальция 0.4 мг

Инозит2 мг

Никотиновая кислота 0,4 мг

Хлоргидрат тиамина 0,4 мг

Хлоргидрат пиридоксина0,4 мг

п-Аминобензойная

кислота0,2 мг

Рибофлавин0,2 мг

Фолиевая кислота0,01 нг

Водадо 1 л

(II) Культурная среда В . Глицерин10 г Пептон 5 г Экстракт солода 3 г Дрожжевой экстракт 3 г Дистиллированная вода Остальное (рН 7,2)

(III) Культурная среда С Дрожжевой экстракт 3 г КН2Р04 0,5 г . К2НР04 0,5 г MgS04 7H20 0,5 г Дистиллированная вода Остальное (рН 7,2)

(2) Индуктор фермента

Индукторами фермента, предназначенными для индуцирсвания и продукцирова- ния нитрилгидратазы в микроорганизме Rhodococcus rhodochrous могут служить любые пригодные для этой цели вещества.

Типичными индукторами, пригодными для настоящего изобретения являются нитрилы и амиды.

Примеры индукторов фермента, чье действие подтверждено для штамма 1-1, включают следующие соединения: кротона- мид, ацетонитрил, пропионитрил, бенза- мид,пропионамид, ацетамид, изовалеронитрил. н-бутиронитрил, изобути- ронитрил, н-кзпррнитрил, 3-пентеннитрил, пивалонитрил, н-бутирамид, изобутирамид, н-валерамид, н-капронамид, метакриамиди фенилацетамид.

(3) Источник ионов кобальта

Нитрилгидратаза не образуется даже в случае присутствия в культурной среде индуктора фермента, поэтому в соответствии с настоящим изобретением существенным моментом является присутствие в ультур- ной среде ионов кобальта.

Поскольку культурной средой является водная среда, наличие ионоо кобальта, как правило, создают добавлением в культурную среду водорастворимого соединения 5 кобальта. Водорастворимые соединения кобальта приводятся в химических справочниках, так что специалист без затруднений выберет и будет использовать приемлемое соединение (в некоторых случаях с по- Ю мощью простых предварительных опытов). Типичными соединениями кобальта являются соединения, дающие ионы Со44 и , в особенности, соединения, образующие ионы Со , и конкретные примеры соедине- 15 ний кобальта включают: хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта, бромид кобальта, борат кобальта и г.п. (4) Культивирование Кулыивирование с целью -F---I.J- 20 ния и накопления нитрилгидратазы в бактериальных клетках может быть осуществлено культивированием используемого микроорганизма, например, штамма 1-1 в культурных средах, описанных выше, в приемлемых 25 условиях.

Витамин В12 и металлический кобальт являются другими примерами кобальтовых соединений, т.к. они образуют is situ ион кобальта в культуральной среде через i . 0 зационное и окислительное действие микроорганизма в течение культивирования,

Количество используемого индуктора фермента составляет 2-6 г на литр культурной среды, количество ионов кобальта со- 5 ставляет 5-15 г на литр культурной среды в пересчете на CoCl2.

Конкретные примеры состава культурных сред приводятся ниже,

(I) Культурная среда А1 литр 0 Ацетонитрил (индуктор) 2 г

СоС12Юмг

(II) культурная среда В1 литр Изовалеронитрил 2 г CoCl2 Юмг 5 (III) Культурная среда С 1 литр Кротонамид . 2 г CoCl2 10 мг Нитрилгидратаза может быть с успехом продуцирована культивированием при 0 встряхивании штамма 1-1 в температурном интервале 15-50°С, предпочтительно 20- 45°С, наиболее предпочтительно около 30°С при рН 7-9 в течение примерно 30 часов или более, предпочтительно 40 часов 5 или более (при верхнем пределе около 120 часов). Индуктор фермента предпочтительно присутствует на начальном этапе культивирования и для получения бактериальных клеток с высокой активностью желательно добавление индуктора. Например, если

встряхивание культуры проводят при 28°С в течение 76 часов добавляют дополнительные количества кротонитрила спустя 26 и 56 часов после начала реакции с тем, чтобы его концентрация в каждый момент составляла 0,2% (мае./об.). .. 4) Гидратация нитрила- - Преамбула настоящего изобретения, звучащая как способ получения амидов биологическим путем, в котором нитрил гидра- тируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом, включает, как указано выше, различные приемлемые оформления и вариации пути действия нитрилгидратазы на нитрил.

Один из вариантов заключается в продуцировании амида в культурной среде микроорганизма, в которой в качестве субстрата присутствует нитрил.

Другой вариант вызвать действие нитрилгидратазы на субстрат заключается в добавлении субстрата(нитрила) в культурную среду, в которой накоплена нитрил гидрата- за, с проведением реакции гидратации. Видоизменением приведенного варианта является использование культурной среды, в которой клетки микроорганизма были разрушены с образованием культурной среды, в которой накоплена нитрилгидратаза.

Еще один вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на ее субстрат заключается в выделении клеток, в которых накоплена нитрилгидратаза, из культурной среды, предпочтительно путем нанесения клеток на приемлемый носитель или путем их иммобилизации с последующим их контактированием с субстратом. Этот способ, в частности, рекомендуемый вариант,,в котором применяют иммобилизованные клетки, как полагают, приемлем для промышленно- го использования и в этом отношении более предпочтителен по сравнению со вторыми вышеприведенными вариантами. Методика с применением иммобилизованных клеток хорошо известна, то же самое относится и к типу носителя, в целом же - это способ иммобилизации клеток на носителе и испрль- зованиеиммобилизованного микроорганизма в так называемом биореакторе.

Другой вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на субстрат заключается в получении ферментивного препарата нитрилгидратазы и гидратировании нитрила с помощью ферментивного препарата, но не биологическим путем. Очевидно, что проведение реакции гидратации этим путем должно быть осуществлено при таких значениях рН и в таком температурном интервале, при которых активность фермента не теряется. Можно сказать, что эти условия будут теми же, что и в случае гидратации биологическим путем, приведенном выше. Как показано выше, вариант, в котором микроорганизм отсутствует в ходе действия фермента, в настоящем изобретении также рассматривается как способ получения биологическим путем.

Согласно настоящему изобретению приемлемый интервал значений рН для нитрилгидратазы составляет 7-9 при оптимальном значении рН 8. При значении рН в растворе ниже 7 активность фермента име5 ет тенденцию к резкому уменьшению. Соответственно, желательно добавление в реакционный раствор буфера. Даже при использовании одного из таких буферов как калийфосфатный буфер, буфер трис-HCI, бу0 фер HEPES-KOH и натрийборатный буфер ферметивная активность нитрилгидрэтазы не меняется.

Концентрация субстрата в культурной среде или в растворе, реакции гидратации,

5 как правило, составляет интервал 4-1 молей на литр, температурный интервал реакции обычно 10-30°С.

3. Экспериментальные образцы. Способ измерения активности нитрил0 гидратазы и определение единицы активности в экспериментальных образцах приводятся ниже.

(1) Способ определения активности нитрилгидратазы.

5 Активность нитрилгидратазы измеряют проведением реакции с 2 мл реакционной смеси, содержащей 10 мМ бензнитрила, 30 мМ калийфосфатного буфера (рН 7) и определенное количество клеток микроорганиз0 ма (выделенных из культурной среды) 5 минут при 10°С и добавлением 2 мл 1 н. HCI для прекращения реакции.

(2) Определение для единицы активности

5Одну единицу (Е) активности нитрилгидратазы определяют как количество фермента, необходимое для образования бензамида из бензнитрила в вышеприведенных условиях со скоростью 1 0 мкмоль/мин.

Ссылочный пример 1. Штамм 1-1 культивируют в культурной среде, состав которой приведен ниже, в условиях, которые также приводятся ниже, и 5 проявления активности нитрилгидратазы выявляют добавлением CoCl2 и/или к культурной среде в ходе культивирования. (1) Состав культурной среды КомпонентКоличество

(в литре среды)

Витаминная смесь3 мл

КгНРСм0,5 г

КН2Р040,5 г

MgS04 7H200,5 г

Пропионитрил2 мл

Дистиллированная

водаОстальное (рН 7,2)

(I) Условия культивирования

28°С, 70-80 часов

Полученные результаты приводятся в табл. 1.

Можно видеть, что активность нитрил- шдратазы не проявляется даже при добавлении FeSO/i к базовой среде, но проявляется при добавлении CoCte, причем добавление в систему, в которую уже добавлял Coda, неблагоприятным образом влияет на результаты,

Ссылочный пример 2.

Действие различных нитрилов или амидов с качестве индукторов штамма 1-1 показано а нижеприведенной Таблице.

Приведенные в табл. 2 результаты получены предварительным культивированием штамма 1-1 в вышеописанной культурной среде В при 28°С при добавлении нитрила или амида в качестве индуктора в количестве 0,1% (об./об.) или 0,2% (мас./об.) соответственно после достаточной .пролиферации штамма с последующим заражением штаммом вышеприведенной культурной среды С, в которую добавлено 0;001% (мас./об.) CoCl2, и культивированием 36-48 часов.

П риме р 1. Клетки штамма 1-1,-полученные культивированием штамма в культурной среде, состоящей из вышеописанной культурной среды С, в которую добавлены CoCl2 и кротонамид в количествах соответственно 0,01 г и 2 г на литр среды, вводят в реакцию с различными, используемыми в качестве субстратов нитрилами. Реакцию проводят использованием 2 мл реакционного раствора, содержащего клетки, полученные из 2 мл культуры, 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 200 мМ субстрата (25°С, 76 часов). Реакцию прекращают добавлением 0,2 мл 1 н. HCI. Активность нитрилгидратазы по отношению к соответствующим субстратам определяют как отношение израсходованного количест ва субстрата или продукта реакции, опреде- ленное с помощью ЖХВД, к активности нитрилгидратазы, определенной при использовании в качестве субстрата 3-циано- пиридина, и называют удельной активностью (%).

Полученные результаты приводятся ниже.

СубстратУд. активность(%)

3-Цианопиридин100 Акрилонитрил 106

4-Цианопиридин129 2-Цианопиридин 64 5 5-Цианоиндол 9

2-Тиофенонитрил116 2-Фуронитрил 71 Бензонитрил 80 4-Цианофенол 24 п-Аминобензни трил 46 м-Нитробемзнитрил 7 о-Нитробензнитрил 16 м-Хлорбензнитрил 29 п-Толунитрил 5 5 м:Толунитрил 46 Анизонитрил 20 о-Хлорбензонитрил 41 п-Хлорбензнитрил 7 2,4-Дихлорбензнитрил 2 0 2,6-Дихлорбензнитрйл 1 Цианопиразин 80 П р и м е р 2. В колбу Сакагучи на 1 литр помещают 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды 5 С, в которую добавлены и кротонамид в количестве соответственно 0,01 и 2 г на литр среды, и смесь культивируют при 28°С на трясучке. Культивирование продолжают с добавлением в культурную среду 0,2% 0 (масс./об.) кротонамида (800 мг/400 мл) через 30 и 60 часов после начала культивирования.

Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1200 д, 5 15 минут) в центрифужно.м сепараторе (Хитачи, модель SCR 20 В), промывают 0,85% NaCI, вновь центрифугируют и суспендиру- ют в 40 мл вышеописанного раствора. Отбирают в качестве образца небольшое 0 количество суспензии и используют для. подсчета сухой массы бактериальных клеток в суспензии.

Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,33 мг сухих клеток) добавляют к 5 4 мл реакционного раствора, содержащего . 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3-цианопиридина (4,57 М) и реакционную смесь выдерживают в течение ночи при 25°С, добавляя к реакционному раствору 0 0,55 Ми 0,49 М 3-цианопиридина серу 3 и 6 часов соответственно. Через 18 часов после реакции инициирования выход никотинами- да 5,58 М. Соответственно, конверсия составляет 99,5%, что соответствует 5 накоплению никотинамида в количестве 681 г. При данной концентрации продукт реакции затвердевает в результате отложения ни котин а мид.

Полученный в результате никотинамид идентифицируют выделением продукта в

виде кристаллов, проведением элементного анализа, ИК-, ЯМР- и масс-спектрометрии. Никотиновая Кислота не обнаружена.

П р и м е р 3. Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,33 мг сухих клеток, полученных в примере 2) добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и циано- пирззин в различной концентрации. В результате 6-ти часовой реакции четыре моля цианопиразина превращены со 10.0%-ой конверсией в пиразинамид, шесть молей цианопиразина превращены в результате 9- ти часовой реакции. С другой стороны, при добавлении суспензии, содержащей 4,66 мг сухой массы, а не 2,33 мг, как в описанном выше опыте, к аналогичному реакционному раствору (4 мл) 7 М цианопиразина превращают в пиразинамид с конверсией 100% в результате 6-ти часовой реакции, 8 М цианопиразина превращают в результате 9-ти-часовой реакции. Образование пиразинкарбоновой кислоты не обнаружено.

Пиразинамид кристаллизуется из раствора,по мере образования. Кристаллическийосадок отделяют и перекристаллизовывают из метанола. Принадлежность кристаллов пиразинамиду подтверждено элементным анализом, ИК-, ЯМР- и масс-спектрометрией.

Анализ цианопиразина, пиразинамида и пиразинкарбоновой кислоты проведен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Аналогичный анализ также проводился в нижеследующих примерах.

П р и м е р 4. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), полученную в примере 2, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М метакрилонитрила соответствен но через 1 и 3 часа после начала реакции. Спустя 12 часов после начала реакции образуется 9 М метакриламида с конверсией 100%.

В вышеописанной реакции при прибавлении дополнительно 1 М метакрилонитрила через 5 часов после начала реакции получают 10 М метакриламида (конверсия 100%) через 24 часа после начала реакции. Концентрация в 10 М соответствует 851 г метакриламида, которые образуются и накапливаются в пересчете на 1 литр реакционного раствора.

Реакционный раствор разбавляют водой и бактериальные клетки удаляют центрифугированием (12000 д. 15 минут). Свободный,от клеток раствор концентрируют в роторном испарителе и кристаллизуют.

Затем кристаллы растворяют и перекристаллизовывают из воды с получением кристаллического метакриламида.

П р и м е р 5. Суспензию бактериальных

клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 1 М кротонитрила, после чего при 25°С провоДят реакции с пятикратным добавлением в реакционный раствор с интервалом в 1 час метакрилонитрила порциями в 1 М. Через 6 часов после начала реакции получают 6 М кротонамида (конверсия 100%). При добав5 лении к реакционному раствору через 6 и 10 часов порциями из реакции инициирования по 1 М кротонитрила получают соответственно 7 М и 8 М кротонамида (конверсия 100% после 10 и 22 часов соответственно).

0 Концентрация 8 М соответствует 681 г образованного и накопленного кротонамида в пересчете нз 1 литр реакционного раствора. Кристаллизацию кротонамида проводят так, как указано в примере 4.

5

П р и м е р 6. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора , содержащего 10

0 ММ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М ацетонитрила, после чего при 25°С проводят реакцию с добавлением через 1 час и 3 часа после начала реакции инициирования 3 М ацетонитрила и через 6 часов еще 5 М

5 ацетонитрила. Через 12 часов после начала реакции получают 12 М ацетамида (конверсия 100%). Другими словами в пересчете на 1 литр реакционного раствора образуется и накапливается 827 г ацетамида.

0Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугированию. Полученный раствор концентрируют досуха в роторном испарителе, растворяют в метаноле и

5 после кристаллизации из метанола получают кристаллический ацетамид.

Пример. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 2. добавляют к 4

0 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М 3-гидроксипропионитрила. после чего проводят реакцию при 25°С с добавлением в реакционный раствор порциями в ЗМ 3-гид5 роксипропионитрила в общей сложности 4 раза с интерзалом в 1 час после начала реакции. Через 5 часов после начала реакции получают 15 М 3-гидроксипромионамида (конверсия 100%). При добавлении на этом этапе дополнительно 3 М 3-гндроксипропионитрила в реакционном растворе получают 18 М 3-гидроксипропионамида (конверсия 1QO% спустя 11 часов реакции инициирования). В пересчете на 1 литр реакционного раствора это соответствует 1600 г обраэо- ванного и накопленного 3-гидроксипропионамида.

Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугированию. Свобод- ншй от клеток раствор концентрируют в роторном испарителе и кристаллизуют при 20°С. Кристаллы растворяют в изопропано- ле; и после кристаллизации из того же растворителе получают кристаллический 3-гидроксипропионамид.

П р и м е р 8. В колбу Сакагучи на 1 литр прмещэют 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды С,: в которую добавлены CoCl2 и кротонамид в количестве соответственно 0,01 и 2 г на литр среды, и смесь культивируют при 28°С на трясучке. Культивирование продолжают с добавлением в культурную среду 0,2% (масс./об.) кротонамида (800 мг/400 мл) че- риз 26 и 56 часов после начала культивирования и останавливают через 76 часов.

Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1000 д. 20 минут) в цеитрифужном сепараторе (Хи- таЯи, модель SCR 20 В), промывают 0,85% Nad, вновь центрифугируют и суспензиру- ют в 40 мл вышеописанного раствора. Отбирают в качестве образца небольшое количество суспензии и используют для подсчета сухой массы бактериальных кле- то К в суспензии.

Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,96 мг сухих клеток) добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10J мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3-цианспирадин в различной концентрации. В результате 9-ти часовой реакции восемь мдли цианопиридина превращены со 100%- ой конверсией в никотинамид, девять молей 3-циаиопиридина превращены в результате 22-ух часовой реакции, С другой стороны, при добавлении суспензии, содержащей 5,98 мг сухой массы, а не 2,96 мг, как описанном выше опыте, к аналогичному реак- ционному раствору (4 мл) 9 МЗ- ,цизнопиридинз превращают в никотинамид с конверсией 100% в результате 5-ти часовой реакции, 12 М-3 цианопиридина превращают в результате 9-ти часовой реак- ции. Образование кислоты не обнаружено.

Никотинамид кристаллизуется из раствора по мере образования. Кристаллы отделяют и перекристаллизовызают из метанола.

П р и м е р 9. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 1 М безнитрила и реакцию осуществляют при 25°С, добавлял 1 М бензнитрила соответственно через 1,2, 3, 4, 5 и 7 часа после начала реакции образуется 7 М бензамида с конверсией 100% (848 гр/литр).

II р им е р 10. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют 4 мл реакционного раствора содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (оН 8,0) и 1 М 2,6-дифторбензнитрила, и реакцию осуществляют при 25°С добавляя 1 М 2,6-дифторбензнитрила к реакционному раствору после 2, 4, 6 и 8 часов начала реакции инициирования соответственно.

Спустя 22 часа после реакции инициирования получают 2,5 М (393 гр/лит) 2,6- дифторбензамида со 100% конверсией.

Пример 11. Суспензию бактериальных клеток (соответствующую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1 М 2-тиофенкарбонитрила, и реакцию осуществляют при 25°С, добавляя 1 М 2-тиофенкарбонитрила в реакционный раствор спустя 1 час после начала реакции инициирования. Спустя 5 часов после ее начала получают 2 М (254 г/л)2-тиофенкарбоксами- да СО 100% конверсией.

П р и м е р 12. Суспензию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1 М 2-фуронитрила и реакцию осуществляют при 25°С, добавляя 1 М 2-фуронитрила к реакционному раствору спустя 1, 2, 4, 6. 8,

1.1 и 23 часа после начала реакции инициирования соответственно. Спустя 30 часов после начала реакции получают 8 М (888 г/литр) 2-фуранкарбоксамида со 100% конверсией.

П р и м е р 13. Суспензию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг, сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 4 М 3-индолацетонитрила и реакцию осуществляют при 25°С.

Спустя 24 часа после начала реакции инициирования получают 4 М (697 г/л)3-ин- долацетамида со 100% конверсией.

П р и м е р 14. Клеточную дисперсию, полученную в примере 2 и соответствующую 4,66 мг высушенных клеток, прибавляют к 4 мл реакционной смеси, содержащей 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 3 fvl акрилонитрилэ. и 2 М акрилонитрила далее прибавляют через 0,5,1 и 2 часа после начала реакции. Реакция при температуре 25°С приводит к получению через 8 часов после начала реакции 9 М акрилонитрила.. т.е. 640 г/литр, при конверсии 100%.

Формула изобретения

1. Способ получения амидов, включающий гидратацию нитрилов при температуре 10-30°С и рН 7-9, в присутствии нитрилгид- ратазы, полученной в процессе культивиро- р.ания микроорганизмов рода Rhodococcus - процентов нитрилгидратазы, с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности процесса, в качестве микроорганизмов - продуцентов нитрилгидратазы используют штамм Rhodococcus thodochrou.s 1-1 (PERM ВР-1478), или АТСС 33278, или АТСС 33025, .а культивирование ведут в присутствии солей кобальта, которые 1зводят в среду в количестве 5-15 мг/л в пересчете на хлорид двухвалентного кобальта.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что гидратации подвергают алифатический нитрил - акрилопигрил.

3. Способ поп. 1, от л и ч а ю щ и и с я тем, что гидратации подвергают ароматический нитрил - бензонитрил, или о-, м- или п-хлорбензонитрил, или о-, м- или п-фторбензонитрил, или м-нитробензонитрил, или п-аминобензонитрил, или о-, м- или п-толу- нитрил, или 4-цианофенол, или анизонит- рил, или фталонитрил, или изофталонитрил, или терефталонитрил, или 2,6-дихлорбензонитрил, или 2,4-дихлорбензонитрил, или 2,6-дифторбензонитрил, или а-, или /3-наф- тонитрил.

4. Способ по п. 1,отличающийся тем, что гидратации подвергают гетероцик- лические нитрилы-2,-3, или 4-цианопири- дин, или 2-тиофенкарбонитрил, или 2-фуронитрил, или 5-цианоиндол, или циа- нопиразин.

Приоритет по пунктам ф.и. 18.09.87- по пп. 1-4;

26.03.88 - использование цианопирази- на.

Примечание.

П.п. 1, 2, 3, 4 имеют приоритет от 18.09:87. Признак п. 3, касающийся сиполь- зования для гидратации фторбензонитрила, в котором RI и R2 - атом фтора, имеет приоритет 16.09.88. Признак п. 4, касающийся использования цианопиразина имеет при- оритет 26.03.88.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается способов получения амидов биотехнологическим окислением нитрилов. Алифатические, ароматические или гетероциклические нитрилы помещают в среду, в которой культивируют штаммы-продуценты нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous 1-1 (PERM BP-1478) или АТСС 33278, или АТСС 33025. Процесс ведут при 1.0- 30°С и рН 7,0-9,0 в присутствии солей Со. взятых в количестве 5-15 мг/л в пересчете на . 3 з.п. ф-лы.

1 Количество клеток - в пересчете на сухую массу.

2 Е - единица активности согласно вышеприведенному определению, количество клеток

Т а б л и ц а 2

Продолжение табл.2