Способ получения амидного соединения Советский патент 1992 года по МПК C12N9/06 

СЛ

С

Изобретение относится к способам гидратации нитрильного соединения под действием нитрилазы, вырабатываемой микроорганизмами для превращения нитрильного соединения в соответствующее амидное соединение Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта Для этого нитрильное соединение подвергают воздействию штаммов микроорганизмов Corynebacterlum sp PERM ВР- 959, или Corynebacterium sp PERM BP-960, или Nocardla sp. PERM BP-961, или Mlcrococcus sp CRS-497 74, или Brevibactenum sp CBS-717,73, Bacillus sp CBS-494 74, или Bacterlcllum sp CBS- 49674 7табл

Изобретение относится к способу гидратации нитрильного соединения под действием нитрилазы, вырабатываемой микроорганизмами для превращения нитрильного соединений в соответствующее амидное соединение.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Пример 1. Для реализации способа используют следующие микроорганизмы Corynebacterium sp PERM BP-959, Corynebacterium sp. PERM 960, Nacardia sp. PERM BP-961. Micrococcus sp CBS-497.74. Bacteridium sp. CBS 49674, Brevibactenum sp. CBS 717.73, Bacillus sp CBS 494 74

Смесь (рН 7,2), включающую глюкозу 1%, пептон 0,5%. экстракт дрожжей 0,3%. солодовый экстракт 0,3% и сульфат железа

7 гидрат 0 05%, помещают в 500 мл колбу Эрленмейера После стерилизации в смесь вводят штамм N-774 (Corynebacterium) и культивируют его в течение 2 дней при температуре 30°С Затем культивируемые клетки собирают центрифугированием, промывают О 05М фосфатнымiбуфером (рН 7,7) и получают промытые клетки. Эти клетки диспергируют в 0.05М фосфатном буфере и получают суспензию клеток с концентрацией 17,3 г сухих клеток/литр. Суспензию клеток оставляют при температуре 0°С в темном месте на 3-4 дня.

Клетки стоящие в темноте, облучают при температуре 0°С в течение 1 ч светом с энергией 57 мкэ/г клеток-сек. используя лампу дневного света. 100 мл суспензии клеток, стоящих в темноте (или на свету).

XI

СЛ

XI

4 х| GO

СО

трижды в темноте пропускают через французский пресс при давлении 1300 кгУсм- длр разрушения клеток, получают 90 мл раствора, содержащего разрушенные клетки, который далее называют раствором разрушенных клеток. 50 мл раствора разрушенных клеток центрифугируют со скоростью 15000 об/мин, используя высокоскоростную центрифугу, и получают 45 мл жидкого экстракта, из которого выделяют остаток клеток. В соответствии с обычным способом из жидкого экстракта удаляют фракции нуклеиновой кислоты и сульфата аммония и получают 15 мл сырого раствора фермента, который удаляют с помощью диализа и принадлежащий фракции, полученной 50-60%- ным насыщением сульфата аммония. Все вышеописанные операции быстро осуществляют в комнате с низкой температурой 4°С, при интенсивности светового облучения 0,02 мкВ/м2 с или меньше, за исключением особо оговоренных случаев, Затем 0,2 мл суспензии клеток, или раствора разрушенных клеток, или жидкого экстракта, или сырого раствора фермента и 4,8 мл 0,05М фосфатного буфера (рН 7,7) смешивают и затем 5 мл 0.05М фосфатного буфера (рН 7,7), содержащего 5 мас.% акрилонитрила, добавляют в эту смесь. Смесь вводят в реакцию при температуре 0°С. После завершения реакции полученный акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии для определения скорости реакции. Для осуществления реакции используют светонепроницаемые реакционные трубы с черными полосками. Скорость образования акриламида (далее АА) представлена через количество АА, полученное за 10 мин.

Сравнительные данные по скорости реакции для каждого из описанных источников нитрилазы представлены в табл. 1.

Пример 2. Клетки, стоящие в темноте, раствор клеток, стоящих в темноте, жидкий экстракт и сырой раствор фермента, приго- тобленные из указанных клеток, получают так по примеру 1. Каждый препарат подвергают облучению светом в течение 10 мин, используя лампу дневного света, описанную в примере 1, и определяют количество АА, полученное за 10 мин.

В табл. 2 приведены результаты сравнения количества АА, полученного за 10 мин с количеством АА, полученным в случае отсутствия облучений указанных веществ.

Пример 3. Каждый из препаратов: облученные светом клетки, жидкий экстракт и сырой раствор фермента, полученные в примере 2, выдерживают в темном месте

при температуре 0°С и затем определяют отношение остаточной активности,

Результаты представлены в табл. 3, где количество АА, полученное за 10 мин при

немедленном использовании после облучения, обозначают как 100%, а отношение остаточной активности - сравнительной величиной.

Пример 4. 5 мл каждого из жидких

экстрактов из клеток, стоящих в темноте, полученных по примеру 1, помещают в 50 мл стальные сосуды и подвергают облучению светом с длиной волны 300-400 нм в течение 3 мин, используя лампу ультрафиолетового света, причем световую энергию регулируют с использованием фильтров с различной оптической площадью, помещенных в верхней части сосудов. В результате получают несколько образцов жидкого экстракта с различным количеством световой энергии и определяют скорость реакции.

Влияние общего количества световой энергии на скорость реакции выражают как отношение к 1, что представляет собой относительную величину, выражающую скорость реакции в случае, когда использованный жидкий экстракт не получает светового облучения.

В табл. 4 показана зависимость скорости реакции от общего количества световой энергии.

Пример 5. 5 мл каждого из жидких

экстрактов клеток, стоящих в темноте, полученных по примеру 1, помещают в стальные сосуды емкостью по 50 мл и подвергают облучению светом с использованием лампы дневного света, примененной э примере 1,

причем часть света с длиной волны 430 нм отводят при помощи цветных стеклянных фильтров, каждый реактор имеет одинаковое оптическое окно, расположенное в верхней части реактора, а время облучения

разное для каждого образца. Скорость реакции измеряют, как в примере 1 для каждого образца, получившего различное количество световой энергии.

Влияние общего количества световой

энергии на скорость реакции выражают че- рзз отношение к 1, за которую принимают относительную величину, выражающую скорость реакции в случае, когда используют жидкий экстракт, не подвергавшийся облучению, что показано в табл. 5.

Пример 6. Жидкие экстракты, приготовленные по примеру 1 из клеток, стоящих в темноте, разных классов бактерий, а именно Bacillus (CBS 494), Bacteridium (CBS-496), Micrococcus (CBS-497), Brevibacterlum (CBS-717) и Nocardla (N-775), облучают светом, как в примере 1. Скорости реакции измеряют как в случае облученных, так и в случае не облученных экстрактов.

Скорость реакции для облученных экстрактов выражают как отношение к 1, которая выражала скорость реакции для необлученных экстрактов, что представлено в табл. 6.

Пример 7. Используют жидкий экстракт из штамма N-774 клеток, стоящих в темноте, полученных как в примере 1, которые облучают светом как в примере 2, реакционные растворы готовят по рецептуре, представленной в табл. 7. Реакцию проводят при 0°С в темном месте. Скорость реакции для каждого вещества, приведенного в табл. 7, определяют, измерив количество израсходованного исходного нитрила или соответствующее количество полученного амида, используя газовую хроматографию или эффективную жидкостную хроматографию.

Вид клеток

Вещество, используемое при определении активности

Клетки х

Раствор разрушенных клеток

Жидкий экстракт

Сырой раствор фермента

Клетки х

Раствор разрушенных клеток

Жидкий экстракт

Сравнительный пример.

Сравнительный пример.

Отношение скорости реакции облученного экстракта к скорости реакции необлученного экстракта приведено в табл. 7. Формула изобретения

Способ получения амидного соединения микробиологической трансформацией нитрильного соединения содержимым разрушенных клеток микроорганизма, или внутриклеточного вещества, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве мик- роорганизма используют штамм Corynebacterlum sp PERM BP-959, или Corynebacterium sp. PERM BP-960, или

Nacardia sp PERM BP-961, или Mlcrocdccus sp. CBS-497.74, или Brevlbacterlum sp CBS- 717.73. Bacillus sp CBS 494.74, или Bacteridlum sp CBS-496.74, которые во время трансформации и/или до нее обрабатывают светом с энергией по крайней мере 10 мкэ/г микробных клеток.

Таблица 1

Количество АА, полученное за 10 мин, %

0,017 0,017 0,011 0,015 0.863 0,871 0.687

Таблица2

ТаблицаЗ

Таблица 4

Таблицзб

Таблица 7