Способ определения изотипов антител Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

(21) 4278869/28- Л

(22) 06.04.87

(46) 23.10.89. Бюл. -№ 39

(7J) Научно-исследовательский 1шстнтут эпидемиологии, микробиологии и

инфекционных болезней .(72) Б.В.Каральник, Ю.В.Теплухин

и П.Н.ДерябШ

(53)616.373 (088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 1074531, кл. G 01 N 33/53, 1984.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОТ-ИПОВ АНТИТЕЛ

(57)Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при определении антител любого изотипа, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов. Целью

.изобретения является повышение точности определения. Разработан способ определения изотипа антител, заключающийся в параллельной обработке исследуемой пробы смесями сывороток, каждая из которых содержит в заранее подобранных дозах антитела к тяжелым ие- пям иммуноглобулинов всех,кроме одного изотипов. Смеси выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37°С, вносят в них полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 1,5%. Полученные смеси после экспозиции в течение 0,5-1,0 ч при 18-22 С центрифугируют на холоду в течение 20-30 мин при 20 тыс. об/мин и полученные варианты надосадков исследуют серологически в сравнении с необработанной сывороткой (контроль). Способ обеспечивает точную характеристику активности антител каждого из известных основных изотипов. 3 табл.

С

(Л

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, может быть использовано при определении антител любого изотипа, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов. Целью изобретения является повышение точности определения. Разработан способ определения изотипа антител, заключающийся в параллельной обработке исследуемой пробы смесями сывороток, каждая из которых содержит в заранее подобранных дозах антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всех, кроме одного изотипов. Смеси выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37°С, вносят в них полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 1,5%. Полученные смеси после экспозиции в течение 0,5-1,0 ч при 18-22°С центрифугируют на холоду в течение 20-30 мин при 20 тыс. об/мин и полученные варианты надосадков исследуют серологически в сравнении с необработанной сывороткой (контроль). Способ обеспечивает точную характеристику активности антител каждого из известных основных изотипов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является повышение точности определения антител различных изотипов, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов.

Поставленная цель достигается путем параллельной обработки исследуемой пробы до исследования смесями сывороток, каждая из которых содержит антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всех, кроме одного, изо- 1ТИПОВ (одна сыворотка содержит антитела ко всем тякелым цепям, кроме о , другая ко всем, кроме |U, третья ко

всем, кроме у, и т.д.), последующей экспозиции смесей в течение 1,5-2 ч, удаления образовавшихся иммунных комплексов и последующего определения

активности антител.

Пример I. Выбор разведений антиглобулиновых сывороток. Исследуемую сыворотку больного описторхо- зом в разведении 1:3 разделяют на 10 частей по 0,2 мл. Первую - третью части смешивают с 0,2 мл анти-о сыворотки (в разведении 1:50, 1:100 и 1:200 соответственно), четвертую - шестую части - с анти- |U сывороткой в таких же разввлтени-ях, седьмую - девятую части - с анти- у сывороткой в

Сл

о со

00

тех же разведениях, десятую часть - с таким же объемом О,85%-ного раствора хлорида натрия (контроль). Все части выдерживают в течение 2 ч при . Затем удаляют образовавшиеся иммунные комплексы. Для этого в каждую часть вносят по 0,4 мл 3%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Через 30 мин смеси центрифугируют при 200 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочные жидкости исследуют (каждую в четырех повторностях при помощи РПГА с описторхозным диагностику- мом.

Результаты приведены в табл. I.

Из табл. 1 видно, что наибольшее снижение активности антител в исследуемой сыворотке происходит в результате обработки каждой антиглобулинно сывороткой в разведении 1/100. Следовательно, каждая из смесей антигло- булиновых сывороток должна содержать соответствующие сыворотки в разведении 1/100.

Пример 2. Выбор условий экспозиции исследуемой сыворотки и смеси антиглобулиновых сывороток. Обработку сыворотки больного описторхо- зом смесью анти- J- анти-oiсывороток проводили аналогично примеру 1. Отличия заключались только в различных условиях экспозиции исследуемой сыворотки со смесью указанных антиглобулиновых сывороток.

Результаты приведены в табл. 2.

Титр общей активности антител до обработки смесью антиглобулиновых сывороток составлял 1:800. Наибольшее снижение титра РПГА произошло при 37°С и экспозиции не менее 90 мин. Значительное увеличение экспозиции технически нецелесообразно. Следовательно, оптимальными условиями экспозиции являются температура 37 С и длительность обработки сыворотки 1,5-2 ч.

Пример 3. Исследованы при помощи РПГА сыворотки крови двух больных описторхозом (А-а и Д-й) и одного больного дизентерией (П-а).

По известному способу каждую ис- следуем то пробу сыворотки титровали, начиная с разведения 1:6, в объеме 0,025 мл в четырех рядах. Во все лунки первого ряда (контроль) внесли в объеме 0,025 мл растворитель - забу- ференный, рН 7,2, 0,85%-ный раствор хлорида натрия. Во все лунки второго

5

0 5

Q

0

5

0

ряда в том же объеме внесли анти-У сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100, третьего ряда - анти-«ь сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100, четвертого ряда - анти- (Ц сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100. После выдерживания смесей при в течение 30 мин во все разведения сьшоротки больных описторхозом внесли по 0,025 мл 0,5%- ного описторхозного, а рядов сыворотки больного дизентерией - дизентерийного антигенного эритроцитарного ди- агностикума. Результаты учли через 2 ч (табл. 3). Исследование каждой сыворотки провели дважды.

По предлагаемому способу исследуемую пробу сыворотки в разведении 1:3 разделили на четыре части по 0,2 мл. В первую часть (контроль) внесли 0,2 мл растворителя (забуференный, рН 7,2, 0,085%-ный раствор хлорида натрия), во вторую - 0,2 мл смеси, содержащей анти-а (1 :1 00) и анти-|1( (1:100) сыворотки. В третью внесли 0,2 мл смеси, содержащей анти-у (1:100) и анти-п/1 (1 : 100) сыворотки, i в четвертую - 0,2 мл смеси, содержащей анти- jj (1 :1 00) и анти-(xL(l : 100) сыворотки. Смеси выдерживали при 37 С в течение 2 ч. Затем в каждую смесь внесли по 0,4 мл 3%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Через 0,5 ч после этого все четыре смеси центрифугировали при 20 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость каждой пробы титровали в одном ряду с разведением 1:12 в объеме 0,05 мл. Во все разведения каждой сьшоротки внесли по 0,025 мл 0,5%-ного соответствующего антигенного эритроцитарно- го диагностикума. Результаты учли через 2 ч (табл. 3). Исследование каждой сыворотки провели дважды.

По известному способу обработка анти-у сывороткой, возможно, снижает титр РПГА, но последний точно учесть не удается, так как слабая агглютинация (на 1+ или 2+) продо/ша- ется дальше - до 1:96 - 1:144 по сравнению с четко (на 3+ или 4+) выраженной агглютинацией - до 1:48. Даже если весьма условно учитьшать реакцию только на 3+ и 4+, оценить изотиповую принадлежность антител в исследуемой сыворотке можно было бы только приблизительно - сравнением результатов в колонках 3-5 с конт51

рольным результатом (колонка 2 табл. 3). На этом основании можно было бы только судить о том, превышает ли активность антител, относящихся, например, к изотипу IgG, активность антител других изотшюв. По такой ориентировочной оценке можно полагать только, что активность IgG антител в сьгооротках, вероятно, выше активности антител других изотипов. По известному способу антитела изотипов IgA и IgM у больных описторхозом не выявлены, а у больной дизентерией выявлены только IgM антитела.

По предлагаемому способу в иссле- цованных сыворотках больных описторхозом активность антител к опистор- хозному антигену содержится, в основном, в изотипе IgG: инактивация антител других изотипов - IgA и IgM (колонка 7 табл. 3) не снижает или почти не снижает титр РПГА по сравнению с контролем. Существенно меньшая активность антител содержится в изотипе IgM (колонка 9) и особенно в изотиле IgA (колонка 8), но антитела этих изотипов четко выявляются. В сыворотке больной дизентерией по предлагаемому способу определена наибольшая активность антител изотипа IgM, меньшая - IgG и минимальная - IgA.

Исследованная сыворотка больной дизентерией была разделена на фракции на колонке с сефадексом G 200. Полу- чены три пика - IgM, IgA и IgG. Исследование активности антител в каждом из этих пиков показало, что в сыворотке наиболее высока активность ilgM антител, но активность антител, хотя и менее выраженная, обнаружена в пиках IgG и IgA. Таким образом, результаты, полученные предлагаемым способом, находятся в более точном соответствии с результатами иммунохи мического фракционирования сыворотки чем результаты, полученные известным способом. По предлагаемому способу можно выявить активность антител давух и более изотипов в тех пробах.

6981

где по известному способу определяются антитела только одного изотипа. Активность антител любого изотипа может быть четко оценена независимо от ее соотношения с активностью антител других изотипов.

Предлагаемым и известным способами параллельно исследованы с иммуно- 0 реагентами соответствующей специфичности сыворотки крови 24 больных с различными диагнозами. IgM антитела выявлены у 18 и 10 больных по предлагаемому и известному способам соответст- 5 венно (различие достоверно: 0,016) , IgG антитела - у 21 и 5 больных (Рс «llO), IgA - у 14 и 2 больных (Р 0,0007). В целом антитела двух и трех изотипов в одной сьшоротке об- 0 наружены известным способом в 2 и О сыворотках соответственно, а предлагаемым - достоверно (,008) чаще - в 10 и 11 сыворотках. О том, что предлагаемый способ позволяет опреде- 5 лять антитела того или иного изотипа только при их наличии в пробе, свидетельствует, что в трех сыворотках антитела вообще не были определены любым из двух способов.

0Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения изотиповой принадлежности антител.

5 Формула изобретения Способ определения изотипов антител путем приготовления нескольких серий исследуемых проб сыворотки, внесения в них специфических антител

40 к тяжелым цепям иммуноглобулинов классов А, G, М, инкубации смеси с последующей оценкой снижения титра антител, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности

45 определения, в каждую исследуемую

пробу вносят одновременно смесь антител к тяжелым цепям двух классов иммуноглобулинов, а инкубацию осуществляют в течение 1,5-2 ч с последующим

50 удалением иммунных комплексов.

Примечание. В скобках указано количество определений .i

Таблица 2

Примечание.В скобках указано количество определений.

Таблица 1

Таблица 3