Способ обнаружения антигенов энтеробактерий Советский патент 1986 года по МПК A61K39/02 

1

Изобретение относится к медицине, в частности к с€фологической диагностике.

Цель изобретения - повьшение специфичности и чувствительности анализа антигена энтеробактерий в фекалиях с помощью эритроцитарных диагностик умов .

Указанная цель достигается тем, что до кипячения исследуемый образец трижды отмывают физиологическим раствором, затем образец кипятят, отделяют надосадок и используют для анализа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а осгцок исследуют с антимикробными сыворотками в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Постановка РТПГА.по известному способу включает агглютинацию диагностикума антисывороткой в заранее подобранной (2-4 гемагглютинирующие единицы) и проконтролированной рабочей дозе, истощенной надосадком фекалий .

Использование отмытого оса,цка существенно повьшает специфичность и чувствительность РТПГА.

Дня постановки РПГА по пре.цлагаеl ioMy способу используют супернатант, полученный путем центрифугирования предварительно отмытого, эмульгиро-, ванного и кипяченого осадка фекалий. Это позволяет существенно повысить ,с.пецифичность РПГА, а значит, и точность серологического анализа,

Предпагаемьш способ осуществляется следующим, Ьбразом.

Исследуемую пробу фекалий заливают О,,85 %-ным раствором NaC (5-10 объемов), эмульгируют и двух-трехкратно отмывают свежими порциями 0,85 %-ного раствора NaCI и прогревают в кипящей водяной бане в течение 60-90 мин, после чего центрифугируют. Часть надосадочной жи : кости отбирают дпя исследования с помощью РИГА., а оставшуюся часть эмульгируют и смешивают с равным объемом антисыворотки в стандартном разведении, После 30-60 мин экспозиции пробу центрифугируют и надосадок исследуют с помощью РТПГА.

Пример. При обследовании больного на дизентерию проведен поиск в фекалиях антигенов щигелл 6 специфичностей (Флекснера, Зонне Ньюкасла, Штуцера- Шмитца, Григорье14г

ва - Шига и Ларди-Сакса) по известному и предлагаемому способам.

По известному способу фекалии заливают 10 объемами 0,85 %-ного раствора NaCl, прогревают в кипящей водяной бане 60 мин, центрифугируют и исследуют надосадок с помощью РПГА и РТПГА.

По преддтагаемому способу фекалии заливают произвольным объемом 0,85 %ного раствора NaCl, эмульгируют (перемешивают стеклянной палочкой) и отмьшают дважды свежими порциями 0,85 %-ного раствора NaCl путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 15 мин. После этого к осадку добавляют 5-кратный объем 0,85 %-ного раствора NaCl, эмульгируют, прогревают в кипящей водяной бане 60 мин и центрифугируют при 3500 об/мин 15 мин. Затем 0,5 мл супернатанта отбирают для исследования с помощью РПГА, для чего в планшете микротитратора готовят 6 одинаковых рядов последовательных разведений супернатанта в объеме 0,05 мл на 0,85 %-ном растворе NaCl, содержащем 0,4 % нормальной лошадиной сыворотки, рН 7,07,2, и вносят в каждый ряд определенный антигенный диагностикум в объеме 0,025 мл. Учет РПГА по обычной методике через 1,5-2 ч.

Остаток пробы эмульгируют, вносят в нее равный объем смеси шигеллезных сывороток 6 специфичностей (конечное разведение каждой сьшоротки в неадсорбированной смеси 1:100, в адсорбированной смеси 1:25) и вьщерживают 40 мин при комнатной температуре Затем пробы центрифугируют при 3500 об/мин в течение 15 мин, отбирают 0,5 мл супернатанта и исследуют

с помощью РТПГА. I .

Для этого готовят в планшете микротитратора 6 одинаковых последовательно разведенных рядов супернатанта в объеме 0,05 мп на 0,85 %-ном растворе NaCl. Для постановки контроля к 0,5 мл исходной смеси сывороток добавляют равный объем 0,85 %ного раствора NaC и готовят 6 рядов разведений смеси антисывороток. В каждый ряд (1 опытный и 1 контрольный) вносят по 0,025 мл определенного 0,5 %-ного антигенного днагностикума. Учет через 1,5-2 ч по обычной схеме для РТПГА. Присутствие антигена устанавливают по степени истощения гомологичной антисыворотки. В результате при обнаружении анти генов различных видов шигелл с помощью РИГА по известному способу идентифицировано 17 образцов (42 %), с помощью РТПГА - 14 образцов (34 %), по предлагаемому способу - 23 и 37 (56 и 90 %) соответственно. Предлагаемый способ позволяет зна чительно повысить специфичность анализа за счет удаления активных растворимых агентов и повысить чувствительность индикации дпя многоэтапных реакций (РТПГА). Предлагаемая модифи нация РТПГА, когда истощение сыворот ки идет за счет суммы растворимого антигена и микробных клеток, присутствующих в осадке фекалий, позволила в ряде случаев превысить порог индикации, характерный даже для антигенных диагностикумов и в целом повысить результативность серологического анализа. Таким образом, предлагаемый способ обнаружения антигена с помощью эритроцитарньгх диагностикумов позво144ляет значительно повысить точность серологического анализа (на 15-60%) за счет повышения специфичности (для РПГА и РТПГА) и чувствительности (для РТПГА) индикации антигена. Значительные затраты времени на отмывание осадка фекалий (30-40 мин) компенсируются снижением затрат труда и времени на выбор и контроль доз антисыворотки для нейтрализации по известному способу (3-3,5 ч). Формула изобретения Способ обнаружения антигенов энтеробактерий путем исследования в реакции пассивной гемагглютинации супернатанта, полученного после кипячения образца фекалий и центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности анализа, до кипячения образец отмывают физиологическим раствором, а после отделения супернатанта осадок фекалий дополнительно исследуют в реакции торможения пассивной гемагглютинации антимикробными сьшоротками.