Способ культивирования эмбрионов птиц Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

1

(21)4380291/30-13

(22)16.02.88

(46) 30.10.89. Бкш. 40

(71)Украинский научно-исследовательский институт птицеводства

(72)Н.И, Сахацкий и А,И. Михайлик

(53)578.085.23(088.8)

(56)Кричинская Е.Б„, Ефремов В.И, Методы биологии развития, М.: Наука, 1974, с. 125.

Авторское свидетельство СССР 1358872, кл. А 61 К 7/00, С 12 N 5/00, 1986.

(54)СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ ПТИЦ

(57)Изобретение относится к биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбриологии, криобиологии, клеточной и генной инженерии. Цель изобретения - повьппение жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощение способа. Для этого используют эмбрионы конца бластулы - начала гаструлы и питательную среду следующего состава, мае.%:.сыворотка крови 6-15; эмбриональный экстракт 5-20; солевой раствор остальное. Использование предпагаемого способа по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: существенное повышение жизнеспособности трансплантированных эмбрионов, упрощение способа и сокращение на 10-20 мин времени, необходимого дпя трансплантации 1 эмбриона, расширение области применения способа. 2 табл.

i (Л

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбриологии, криобиологии, клеточной и генной инженерии. Цель изобретения - повышение жизнеспособности пересаживаемых эмбрионов и упрощение способа. Для этого используют эмбрионы конца бластулы - начала гаструлы и питательную среду следующего состава, мас.%: сыворотка крови 6-15

эмбриональный экстракт 5-20

солевой раствор остальное. Использование предлагаемого способа по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: существенное повышение жизнеспособности трансплантированных эмбрионов, упрощение способа и сокращение на 10-20 мин. времени, необходимого для трансплантации 1 эмбриона, расширение области применения способа. 2 табл.

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в экспериментальной эмбриологии, криобиологии, эмбриоинженерии, клеточной и генной инженерии.

Цель изобретения - повышение жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощение способа.

Пример. Дпя осуществления способа используют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, источником которых являются свежеснесенные яйца кур итальянской ку- .ропатчатой породы. Дпя воспроизведе - ния известного способа яйца инкубируют в течение 12-42 ч в лабораторном инкубаторе-термостате.

Способ осуществляют следующим образом.

Дпя выделения эмбриона на желток, помещенный в чашку Петри бластодис- ком вверх, накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, внутренний диаметр которого дпя удобства в дальнейшем должен превьппать на 2-3 мм наружный диаметр используемой дпя культивирования эмбрионов камеры. При этом стремятся к тому, чтобы бластодиск оказался в центре кольца. Под желточную оболочку инъецируют физраствор в количестве до 5 мл (в качестве.физраствора используют любой из известных солевых растворов: Рингера, Говарда, Тироде, 0,9-12-ный раствор хлористого натрия и др.). Затем ее обрезают по наружному краю кольца. Пинцетом за край кольца препарат переносят в чашку Петри с физСП

00 09

раствором и споласкивающими движения- tи в растворе смывают эмбрион с желточной оболочки. Смытый таким путем эмбрион используют для криоконсерва- ции или других экспериментальных целей. Оставшаяся после отделения эмбриона желточная оболочка может быть использована в качестве подложки для посадки на нее эмбриона. При этом не имеет значения свой эмбрион на нее будет трансплантирован или чужой. -Тля приема трансплантата ее подготавливают. Вначале дополнительно очищают в растворе от остатков желточной массы с помощью скребкг, а затем споласкивают в нескольких г:менах физраствора и помещают для приема трансплантата на камеру для культивирования внутренней стороной вверх,Камеру для культивирования перед этим заполняют питательной средой. Приготовление питательной среды проводят заранее следующим образом. В чистую стерильную посуду отмеривают 10 мл (6-15 мл) сыворотки крови кур, полученной общепринятым способом добавляют к ней 10 мл (5-20 мл) куриного эмбрионального экстракта. Затем об- г й объем питате-пьной среды доводят до 100 мл солевым раствором, в качестве которого лучше всего использо- влть раствор Говарда. Приготовленную таким образом питательную среду стерилизу1ит путем фильтрования чергз мембранные фильтры, например Сынпор с дисзметрок пор 0,22 мкм. Допустима цобавка к питате: Ы1ОЙ среде антибно TV;KOB в общепринятой концентрации; 10000 ед, пеницшшина и 10000 мкг стрептомицина на 100 мл (,

При npoBf zieHHH некоторых исследований или работ, например, в области криобиологии отделенные от собственной желточной оболочки эмбрионы хранят Б замороженном состоянии в течение требуемого времени (до несК :..пъки лет) о Их трансплантапик проводят на желточную оболочку, выделенную из другого яйца. Используют для - I HX целей более дешевые пищевые (неоплодотворенные) яйца. Техника выдапения оболочки и подготовки ее к приему трансплантата остается прежней.

Перед трансплантацией эмбрион помещают в солевой раствор, например в раствор Говарда, и осторожно засасывают его в пипетку, имеющую расширенный конец диаметром 4-5 им (дпя кури0

5

0

5

0

-.

0

5

0

5

mix эмбрионон). Позволяют ему ocecTi) ь пипетке на нижний мениск и переносят в капле раствора на желточную оболочку. Важно, чтобы эмбрион лег на желточную оболочку дорсальной стороной (эктодермой) Если же он лег вентральной стороной или завернулся, тонкой стеклянной пипеткой (папочкой) приводят эмбрион в нужное положение. Затем с помощью топкой пипетки тщательно отсасывают остатки раствора вокруг эмбриона. Чашку Петри с камерами для культивирования, на которые посажаны эмбрионы, накрывают крьш1ка- ми и помещают в термостат дпя культивирования. Первый контроль зд ростом эмбрионов проводят через i2-13 ч.

В табл, 1 приведено обс Снование оп- оптимальпых и граничных пределов ко}г- центрацпи каждого компонента предлагаемой питательной средьк Как тельствуют приведенные данн1-к .% стиму- Л фую1Ц1- м началом рост/г эмб :1ио;- ов яв ляетгя куриный эмбрио}1;алы1ын экстракт., ., при отсутствии н гоставе среды сЕ)1воротки к ; О1;и (0%) и дО : га- точнс большом количестве куриного змбрионсшьно о экстракта (15% и бо- лег:; 70--80% эмбрионов пачил1Л ог iia,-ri - тие. Однако в дальнейшем в процес;се культинирования они в бул щтнг тве спучлек rndjiyT па 2 - -t ст;:.:г1 .ч:-( оятви- TIJH, Сопоставляя э и датгны-. с мслиу ченнь :- и но другим 11араллел -.; ;:Лм груп- i:, учета.) становрп ся t.MPiiHAfn-,.-., :то гибель эмбрионов ;:роисхо11.ит лз-ja отсутствия в cpe/.u; сыворотки крои ,

потребность в КОЧ ОГЛЙ V ЭМ ..

появляется лишь со 2-4 стадий рсзви-- тин Отимяльное соотношение этих двух компонентов (табл„0 -о-с г;|.лч ет., %: сыворотка крови 8-10 (с колебаниями от б до 15); э tбpиoнaJ I; ;ый экстракт 10 (с колеб. от .S до 20); раствор Говарда остзльноо. При указанном соотношении компонептов 80- 100% эмбрионов, трансплантиропанных на желточную o6o.rio4Kyj начинают раз- , а при оптимальном соотношении - 00%. Причем эмбрионы имеют чысокут жизнеспособность; доотит ают 5 ;: последующих стадий развития (до 12-13 стадии),

В табл. 2 представлены данные сравгштапьного испытании эффективности известного и пред;гагаемого способов культивировани.ч рднних куриных эмбрионов. Они сич.г.,;:Т(:шьствуют о су51

ществениом преимуществе предлагаемого способа по результативности даже при использовании в известном способе эмбрионов, достигших до трансплантации третьей стадии развития. При этом в известном способе около 70% эмбрионов прикрепляются и начинают развитие, а в предлагаемом 100%. Еще очевиднее преимущество данного способа при трансплантации по известному способу эмбрионов на первой стади развития (стадия конца бластулы - начала гаструлы). В известном способе лишь 51% из них начинают развитие, а в предлагаемом - 100%. Данное преимущество npejyiaraeMoro способа над известным достигается благодаря использованию более ранних эмбрионов, в частности на стадии конца бластулы - начала гаструлы. обладающих в данном возрасте наивысшей полипотен - ностью и устойчивостью к повреждаю- 1ДИМ внешним факторам, а также из-за использования предлагаемой питательной среды. О значении данной пита- тбшьной среды свидетельствуют данные табл 2, где в известном способе при

Таблица 1

Количество эмбрионов, %, начинающих развитие в зависимости от соотношения компонентов питательной среды

83716

использовании эмбрионов на первой стадии развития и питательной среды из жидкой фракции белка яиц результативность оказалась даже ниже, чем в группе, где использовали эмбрионы на третьей стадии развития

Формула изобретения

Способ культивирования эмбрионов птиц, включающий отделение эмбриона от собственной желточной оболочки и трансплантацию его на другую желточную оболочку с последующей инкубацией в питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощения способа, отделение эмбриона производят на стадии конца бластулы - начала гаструлы, а питательргую среду используют следующего состава, мас,%:

Сыворотка крови Эмбриональный экстракт Солевой раствор

6-15

5-20 Остальное

Таблица 2

Сравнительное испытание эффективности культивирования эмбрионов птиц известным и предлагаемым способами

Предлагаемый

390

390

100

390

100