Способ замораживания эмбрионов кур Советский патент 1990 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано в криобиологии, генетике и клеточной инженерии.

Цель изобретения - повышение жизнеспособности эмбрионов.

Способ осуществляется в следующей последовательности.

Объектом исследований служат эмб рионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, источником которых являются свежеснесенные яйца кур породы род-айланд.

Для выделения эмбриона на желток, помещенный в чашку Петри бластодиском вверх, накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, при этом стремятся k Тому, чтобы бластодиск оказался в центре кольца. Поджелточную оболочку инъецируют физраствором в количестве до 5 мл (используют в качестве физраствора 0,9%-ный раствор хлористого натрия, растворы Рингера, Говарда, Тироде и т.д.). Затем обрезают желточную оболочку по наружному краю кольца и переносят препарат в другую чашку Петри с физраствором. Колебательными движениями в растворе смывают эмбрион с желточной оболочки. Отделенный таким путем от собственной

Сп

ел

СО

СП

10

15

20

Желточной оболочки эмбрион пипеткой (переносят в другую чашку Петри с 8- 2% oL -пропиленгликоля на растворе Говарда, выдерживают 5-10 мин, затем Переносят в контейнер для замораживания, в качестве которого импользуют к примеру алюминиевый цилиндр диаметром 11 мм и высотой 2 мм.

Эмбрион в контейнере в указанном В-12%-ном растворе криопротектора охлаждают со скоростью 50-60 град/мин цо начала процесса кристаллизации, выдерживают в течение с и замораживают до (-18) - (-22)° С со скоростью 30-35 град/мин и до -79°С со скоростью 95-105 град/мин. Скорость (охлаждения контролируют с помощью онтрольно-измерительного устройства, примеру термопары, подсоединенной самопишущему потенциометру ЛКС- - 003. Замороженные эмбрионы хранят при , используя в качестве хладагента твердую углекислоту. Размораживание проводят путем помещения кон- 25 тейнеров с эмбрионами, в раствор (Говарда при 18-22°С. После этого эмбрион выдерживают в течение 5-Ю мин в солевом растворе (растворе Говарда) для отмывки его от криопротектора. Перед размораживанием эмбриона: подготавливают желточную оболочку. Вначале ее отделяют от желтка (используют пищевые, неоплодотворенные, ia также любые другие дешевые яйца) . |Для этого на желток накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, врутрен- ний диаметр которого на 2-3 мм должен превышать наружный диаметр используемого для культивирования камеры. Под кольцо инъецируют физраствор в количестве до 5 мл, а затем обрезают желточную оболочку по наружной стороне кольца и переносят в чашку Петри с физраствором. С помощью 45

15513154

скребка очищают желточную оболочку от остатков желточной массы и укладывают внутренней стороной вверх на камеру для культивирования. Камеру для культивирования перед этим заполняют питательной средой, как и в известном способе.

Размороженный эмбрион пипеткой с расширенным до и5 мм концом переносят на желточную оболочку. При этом стремятся к тому, чтобы эмбрион лег на желточную оболочку дорсальной стороной. Если же он лег вентральной стороной или завернулся, тонкой стеклянной палочкой приводят его в нужное положение. Затем с помощью тонкой пипетки удаляют остатки физраствора вокруг эмбриона. После этого проводят культивирование эмбриона известным способом. Первый контроль за развитием эмбриона проводят через 12- Й ч культивирования.

В описании приведены данные, обосновывающие граничные пределы продолжительности выдержки эамбрионов в растворе криопротектора до замораживания и в солевом растворе после размораживания, а также режима охлаждения, выдержки в течение периода кристаллизации и замораживания до -79 С.

Устойчивость эмбрионов к замораживанию зависит и от продолжительности их выдержки в процессе кристаллизации. При выдержке в течение 25-35 с 25-26% эмбрионов сохраняют жизнеспособность, тогда как при выдержке менее 25 с число жизнеспособных составляет 3-5%, а более 35 с - 15-18%.

Жизнеспособность, % от общего числа, цеконсервированных эмбрионов в зависимости от продолжительности контакта до замораживания с криопротек- тором в различной концентрации приведена в табл. 1.

Таблица 1

30

35

40

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в криобиологии, генетике и клеточной инженерии. Целью изобретения является жизнеспособности эмбрионов. Согласно изобретению используют эмбрион на стадии конца бластулы- начала гаструлы, который отделяют дополнительно от собственной желточной оболочки, выдерживают в течение 5-10 мин в 8-12%-ном растворе-α пропиленгликоля, затем охлаждают со скоростью 50-60 град/мин до начала процесса кристаллизации, выдерживают в течение 25-35 с и замораживают до - 18-22°С со скоростью 30-35 град/мин и до -79°С со скоростью 95-105 град/мин. После размораживания выдерживают в солевом растворе в течение 5-10 мин и трансплантируют для культивирования на подложку, в качестве которой используют желточную оболочку. 6 табл.

1 2 3

ц

5 6 7

Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, % от их общего числа, в зависимости от скорости охлаждения до начала процесса кристаллизации приведена в табл. 2.

Таблица2

Выход, %, жизнеспособных эмбрионов в зависимости от скорости их замораживания от (-18)-(-22)°С до -79°С приведен в табл. Ь.

Таблица k

Прикрепляемость эмбрионов к желточной оболочке в зависимости от продолжительности их выдержки в солевом

1551315

Продолжение табл.2

50 60 65 70

26

25 20 18

Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, % к их общему числу, в зависимости от скорости их замораживания от начала процесса кристаллизации до (-18)-(-22)°С приведена в табл. 3.

Таблиц.а 3

растворе после размораживания приведена в табл. 5.

Таблица 5

В табл. 6 приведены данные сравнительных испытаний эффективности за- мораживания куриных эмбрионов известным и предлагаемым способами. Они свидетельствуют о существенном преимуществе предлагаемого способа перед известным.

Формула изобретения

Способ замораживания эмбрионов kyp, включающий отделение эмбрионов о т желтка, отмывку от желточной мае- Јы, выдержку в растворе криопротек- тора, охлах(дение, отличаю- 1ц и и с я тем, что, с целью повыше- йия жизнеспособности эмбрионов, ис- рользуют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, дополниТаблица 6

тельно проводят отделение от желточной оболочки, в качестве криопротек- тора используют 8-12%-ный раствор оЈ-пропиленгликолл, выдерживают в течение 5-10 мин, охлаждение ведут в три стадии: вначале со скоростью 50-60 град/мин до начала кристаллизации,при которой выдерживают с,а затем со скоростью 30-35 град/мин до (-18)-(-22)°С и со скоростью 95 105 град/мин до -79°С.