Способ получения эмбриональных клеток двустворчатого моллюска МIZUснорестеN YeSSoeNSIS Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к клеточной биологии, к способам культивирования клеток беспозвоночных животных, а именно эмбриональных клеток морского гребешка, и может быть использовано в биотехнологии, медицине, а также в научно-исследовательской работе для получения культуры клеток.

Известен способ получения эмбриональных клеток устрицы, где эмбрион вы- ращивают до стадии трохофоры, обрабатывают раствором коллагеназы и гиалуронидазы, подвергая затем механической обработке. Далее клетки культивируют в морской воде с добавлением гемолимфы (2%), водорослевого гидроли- зата (5%), устричного эмбрионального экстракта (5%) и FCS(10% эмбриональная сыворотка теленка).

Недостаток данного способа заключается в том, что время переживания культуры клеток всего две недели.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения культуры эмбриональных клеток устрицы. Эмбрионы устрицы получают путем искусственного оплодотворения, выращивают до стадии трохофоры, диссоциацию на составляющие клетки проводят раствором трипсина 0,025-0,25% без ионов Са+2 и Мд с добавлением ЭДТА (раствор смягчают добавлением буферных солей). Затем проводят культивирование клеток в питательной среде, состоящей из 30% среды Лейбовича (L-15), 43% морской воды, 10% эмбриональной сыворотки телят, 2.5% устричного личиночного экстракта, 2,5% водорослевого экстракта, 5 мг/мл глюкозы, 0,65

2

СЛ 1 ON VI

мг/мл галактозы. 0,4 мг/мл дрожжевого экстракта.

Клетки культивируют либо в необработанных флаконах либо во флаконах, обработанных полилизином либо фибронектином, либо коллагеном тип III, но не из мышиных хвостов. Время переживания культуры клеток 1 мес. Добавление тканевых фрагменте в взрослых устриц к эмбриональным культурам увеличивает временной период жизнеспособных клеток до 2 мес.

Недостатком способа является меньшее, чем в экспериментах, время переживания культивируемых клеток, что связано с особенностями используемой в среде и субстратов, неэффективность использования субстратов (полилизин, коллаген не из мышиных хвостов) для увеличения клеточного прикрепления и клеточного роста.

Цель изобретения - увеличение длительности переживания клеток.

Для достижения цели эмбрионы гребешка, полученные путем искусственного оплодотворения, выращивают до стадии трохофоры (30-48 ч при 14°С), затем диссоциируют на составляющие их клетки в 0,1%-ном растворе коллагеназы на искусственной морской воде без Са+2 и Мд+2 в течение 1-1,5 ч при б-10°С, пипетируют, промывают дважды в морской воде с антибиотиками и культивируют в питательной среде L-15 (Flow), доведенной основными солями до осмотичности гемолимфы гребешка (110 мОсмоль) и содержащей 1-5% эмбриональной сыворотки телят, таурин, глюкозамин, глютамин во флаконах, предварительно обработанных коллагеном из мышиных хвостов (1 мг/мл).

Источником клеток для получения исходной культуры служат полученные путем искусственного оплодотворения эмбрионы Приморского гребешка. Нерест моллюсков индуцируют инъекциями 0,5-1 мл М раствора серотонина креатинсульфата в гонаду. Эмбрионов выращивают до стадии трохофоры - велигера (30-48 ч при 14°С).

Дезаггрегацию проводят с помощью 0,1% коллагеназы, что дает наиболее стабильные результаты, при этом количество мертвых клеток не превышает 10% и кусочки тканей эмбрион диссоциируют на клетки почти полностью.

Пример 1. Источником исходных клеток служат эмбрионы гребешка, полученные путем искусственного оплодотворения. Нерест моллюсков индуцируют инъекциями 0,5-1 мл М раствора серотонина креатинсульфата в гонаду. Сбор яйцеклеток и спермиев проводят в морской воде, стерилизованной облучением ультрафиолетом, при 14-15°С. Оплодотворенные яйцеклетки отмывают от спермиев и культивируют в закрытых сосудах со стерильной морской водой при постоянном поддуве стерильным воздухом для аэрации и перемешивания. Смену воды проводят через 20 ч при достижении личинками стадии плавающей бластулы. Эмбрионов выращивают до стадии трохофоры (30 ч при 14°С). собирают

0 с помощью газа (30 мкм), промывают искусственной морской водой без Са+2 и затем центрифугируют для концентрирования в небольшом объеме.

Обработку эмбрионов проводят 0,1%5 ным раствором коллагеназы (производство ТИБОХ ДВО АН СССР) в течение 1 ч при 10°С. Полученную массу пипетируют в течение 1 мин для разделения оставшихся агре- гатоо на отдельные клетки, центрифугируя

0 (2 тыс. об/мин, 10 мин), промывают дважды в стерильной морской воде с антибиотиками (пенициллин 500 ед/мл, гентамицин 40 мкг/мл), а затем переводят в питательную среду (гентамицин 40 мкг/мл).

5 В качестве питательной среды используют стандартную среду Лейбовича-15, которая содержит большие концентрации аминокислот, что характерно и для гемолимфы морских моллюсков. К среде добавляют

0 таурин (25 мг/л); глюкозамин 50(мл/л), глютамин (100 мг/л), эмбриональную сыворотку телят 2%. Среду предварительно доводят по основным солям до осмотичности гемолимфы гребешка (1100 мОсмоль). Суспензию

5 клеток (0,5-10 клеток/мл) рассеивают в культуральные флаконы Карреля и пробирки Лейтона, предварительно обработанные коллагеном из мышиных хвостов (Sigma) 1 мг/мл в течение 6 ч и промытые дважды

0 морской водой, помещают в термостат при 15°С. Через сутки после посева производят смену среды путем центрифугирования и ресуспендирования осадка клеток в свежей порции среды. Последующие смены среды

5 проводят через каждые 10 дней в течение 2 мес, а затем через 20 дней. Жизнеспособность клеток в начальный момент посева оценивают с помощью окраски трипановым синим (0,04%-ный раствор на

0 морской воде), акридиновым оранжевым (0,01-0,001 %-ный раствор), двойным флуоресцентным методом (0,001 %-ный раствор флуоресцеин диацетата: 0,0003%-ный раствор пропидиума иодида), а на дальней5 ших сроках культивирования - двойным флуоресцентным методом. Жизнеспособность клеток в момент посева 90%, а затем постепенно снижается до 80% (2 мес культивирования) и до 60% (4 мес культивирования).

П р и м е р 2. Исходную массу отдельных клеток получают как описано в примере 1, но обработку коллагеназой ведут при 6°С 1,5ч.

Полученную массу клеток ресуспенди- руют в среде Лейбовича, доведенной основными солями до осмотичности гемолимфы гребешка 1100 мОсмоль, содержащей тау- рин (25 мг/л); глюкозамин (50 мг/л); глюта- мин (100 мг/л); эмбриональную сыворотку телят 5%, гентамицин (40 мкг/мл), до концентрации 1 106 клеток в 1 мл питательной среды. Клетки культивируют в предварительно обработанных флаконах Карреля объемом 10 мл и 50 мл при 10°С. Через сутки после посева производят смену среды, последующие смены среды проводят каждые 15 дней.

Жизнеспособность клеток и их способность синтезировать РН К и Д Н К проверяют, как описано в примере 1.

В данном случае клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность до 95 сут (к концу культивирования жизнеспособность падает до 60-70%).

П р и м е р 3. Исходную массу клеток получают из эмбрионов со стадии велигер (48 ч при 14°С). как описано в примере 1. Клетки ресуспендируют в среде Лейбовича, доведенной основными солями до 1100 мОсмоль, содержащей глюкозамин (50 мг/л), глютамин (100 мг/мл), 2% эмбриональную сыворотку телят, добавляют антибиотик - гентамицин (40 мкг/мл) до концентрации 0,5 106 клеток в 1 мл питательной среды.

Клетки культивируют в предварительно обработанных коллагеном (1 мг/мл) флаконах Карреля объемом 10мл при 20°С. Через сутки после посева производят смену среды, последующие смены среды проводят каждые 10 дней.

Жизнеспособность клеток оценивают, как в примере 1.

В данном примере клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность в течение 122 дней.

П р и м е р 4. Полученную, как описано в примере 1, массу отдельных клеток эмбрионов гребешка ресуспендируют в среде Лейбовича, содержащую таурин (50 мг/мл), глюкозамин (150 мг/л), глютамин (100 мг/л), эмбриональную сыворотку телят (1%) с добавкой гентамицина (40 мкг/мл), и доводят основными солями до 1100 мОсмоль, до концентрации 0,5 106 клеток в 1 мл питательной среды.

Клетки культивируют в предварительно обработанных коллагеном (1 мг/мл) флаконах Карреля при 15°С. Через сутки после посева производят смену среды, п ос л еду ющие смены среды проводят каждые 15 дней. Жизнеспособность клеток оценивают, как в примере 1.

В данном случае клетки сохраняют свою жизнеспособность и активность в течение

95 сут (к концу культивирования жизнеспособность клеток падает до 60%, но и на этой стадии на препаратах обнаружены клетки в различных стадиях митоза (0,02-0,03%). Таким образом, как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет получить культуру переживающих эмбриональных клеток двустворчатого моллюска Mlzuchopecten yessoensls и обеспечить их жизнеспособность в течение более

чем 3 мес (95-122 дней). Эта задача является актуальной, поскольку известно значительное количество фармакологически и биохимически ценных соединений, выделенных из морских организмов. Для получения таких соединений необходимы, как правило, большие количества животных, многие из которых труднодоступны или малочисленны. Поэтому очевидно, что производство биологически активных веществ из морских

организмов должно быть основано на культурах клеток-продуцентов. Такой подход целесообразен также с экологической точки зрения. Кроме того, морские животные являются незаменимыми объектами эмбриологии, биологии клетки и молекулярной биологии.

Формула изобретения Способ получения эмбриональных клеток двустворчатого моллюска Mlzuchopecten yessoensis, включающий получение эмбрионов на стадии трохофоры- велигера, диссоциацию эмбрионов путем ферментной и механической обработки и

культивирование в питательной среде, состоящей из среды Лейбовича и эмбриональной сыворотки во флаконах, обработанных коллагеном, отличающийся тем, что, с целью увеличения длительности переживания клеток, ферментную обработку проводят 0,1%-ным раствором коллагеназы, а питательная среда содержит 95-98% среды Лейбовича, до 5% эмбриональной сыворотки, 25-50 мг/л таурина, 50-150 мг/л глюкозамина, 100 мг/л глютамина и основные соли, добавленные до осмотического давления 1100 мОсмоль.

Использование: изобретение относится к клеточной биологии, к способам культивирования клеток беспозвоночных животных, а именно эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска. Сущность изобретения: отдельные клетки приморского гребешка получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы на искусственной морской воде без Са+2 и Мд 2. Культивируют клетки в питательной среде, доукомплектованной сахарами, аминокислотами с добавлением эмбриональной сыворотки теленка, во флаконах, предварительно обработанных коллагеном. уЁ