Способ получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года Советский патент 1989 года по МПК A01K61/00 

1

(21)3827994/28-13

(22)21.12.84

(31)4457/83

(32)23.12.83

(33)ни

(46) 30.10.89. Бюл. № 40

(71)Кёзпонти Валто-Еш Хитель- банк РТ, Ииновациош Алап (HU)

(72)Тамаш Гулиаш, Анико Хорват, Дьёрдь Кери, Карой Николич, Балаж Сёке и Иштван Теплан (HU)

(53) 639.3.034 (088.8)

(56) Сельское хозяйство за рубежом,

1978, № 1, с. 43-44.

Aquaculture, 1983, № 35, 1985, с. 173-176.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ половых ПРОДУКТОВ У ПОЛОВОЗРЕЛЫХ РЫБ В ЛЮБОЕ ВРЕМЯ ГОДА (57) Изобретение относится к рыбоводству, направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получения у рыб различных видов. Для этого рыбам в качестве соединения с гормональным действием вводят нонапеп- тид - С,-С4.-алкилам1ады или декапеп- тидамиды общей формулы Glp-His-Trp- Ser-Tyr-X -Xj -X -Pro-X., где X - -p-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu, D-Ser; Xj. Trp, Phe, Leu; X, - Gin или Leu; X - Gly NHj или С ,-С((.-алкил NHj, или их соли. Соединение вводят периодически дозами, количество которых составляет 2 - 15. Величину доз устанавливают в соответствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 Табл.

Кл

Изобретение относится к рыбоводству и направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получения у рыб различных видов. Для этого рыбам в качестве соединения с гормональным действием вводят нонапептид-C₁-C₄ - алкиламиды или декапептидамиды общей формулы GLP-HIS-TRP-SER-TYR-X₁-X₂-X₃-PRO-X₄, где X₁ - D-PHE, D-TRP, D-ALA, D-LEU, D-SER

X₂ - TRP, PHE, LEU

X₃ - GLN или LEU

X₄ - GLYNH₂ или C₁-C₄-алкил NH₂, или их соли. Соединение вводят периодически дозами, количество которых составляет 2-15. Величину доз устанавливают в соотсветствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 табл.

Изобретение относится к рыбоводству, а именно к способу получения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года, независимо от естественного периода нереста.

Половая активность рыб обоих полов регулируется выделяющимися из аденогипофиза гонадотропинами, которые способствуют морфологическому и функцис нальному развитию половых желез ( онлд), их гаметогенетической

(яйце- и спермопродуцирующей) деятельности и секреции половых гормонов.

Аденогипофиз обоих полов у рыб выделяет два одинаковых гонадотро- пина: один носит обозначение FSH (стимулирующий фолликул гормон), другой - LH (лютеинизирующий гормон).

Гонадотропины не специфичны для полов, так как один и тот же FSH способствует гаметогенетической як

О4

тивностн как у самцов, так и у самок; один и тот же LH возбуждает у особей мужского пола секрецию андро гена, а у особей женского пола - ястрона или прогестерона, как FSH, так и I.H являются гликопротеинами, которые обладают вндовон специфичностью для рыб.

Функцию эндокринной системы у ры координирует Г ипофиэ. Кроме тог о, он координирует деятельность эндокринной и нервной систем, в первую очередь через вегетативное клеточное ядро, образующее нижнюю часть 1-ипоталамуса.

Г ипофиэ с помощью видовых специфических тропогормонов регулирует также процесс размножения. 3 естественных условиях овуляция у рыб происходит в специфический для данного конкретного вида среде, ову- ляционно зрелая икра рыб выметывается не самопроизвольно, а находится в состоянии вынужденного покоя вплоть до более или менее продолжительного установления пригодных для овуляции условий окружающей среды.

Эта характерная для рыб адаптаци к условиям размножения регулируется гипофизом и центральной нервной системой совместно. R таком состоянии покоя в кровь рыб выделяется мало гонадотропина.

Для возникновения и формирования среды, подходящей для икрометания, требуется какой-то отрезок времени (например, поздняя осень или начало лета). Это означает, что репродуктивный (воспроизводящий) механизм регулирования у рыб делает возможной адаптацию процесса размножения внешней окружающей среде. Это регулирование представляет собой результат координирующей сыгранности функций гипоталамуса и гипофиза.

Выбрасывание некоторых тропогормонов аденогипофиза регулируется нейрогормонами, которые освобождаются на идущих к отдельным ядрам клеток гипоталамуса нервных окончаниях тотчас резорбируются в так называемых портальных капиллярах и попадают с кровью в синус аденогипофиза.

Все известные нейрогормоны являюся олигопептидами или полипептидами

Нейрог ормоны, стимулирующие секрецию тропогормонов, обозначаются как высвобождающий фактор (RF);

нейрогормоны, поданляющие секрецию гормонов, - как ингиПируюп1ИЙ фактор (IF).

Для всех нейрогормонон отличительным является то, что их действия у .hypophysektomierten животных соответствуют действию, появляющемуся после введения соответствующего

тропогормона.

Базофильные плоскости гипофиза рыб обладают различиями обусловленными сезоном: их количество в период икрометания уменьшается.

В процессе адаптации к окружаю- дей среде образуются высвобождаю- 11 1ие гормоны (RH), которые с током крови попадают в гипофиз и там регулируют- выброс тропогормонов в

кровь.

Таким образом, рыбы получают сведения о существовании окружающей среды, пригодной для икрометания, благодаря чему в гипоталамусе регулир тощий лютеииизирующкй гормон - гормон LH/RH - активизирует гипофиз и выброс гонадотропина в кровь, в результате чего возбуж,аается процесс овуляции.

Когда рыбами воспринимается внешняя окружающая среда, обеспечивающая большие возможности для выживания потомства, то возникают импульсы, которые через органы чувств передаются эндокринной системе желез,

и этот механизм активизирует находящуюся в вынужденном состоянии покоя репродуцирующую (воспроизводящую) систему.

Нейрогормоны чрезвычайно интерспецифичны: LH/RH рыб имеет не такую последовательность, как LH/RH млекопитающих, и оказывает на них такое же малое влияние, как и LH/RH млекопитающих на рыб.

Использование метода гипофизирования (введение гипофиза рыбам путем инъекции) дает возможность индуцировать искусственное размножение рыб.

Для гормонального возбуткдения опуляции используют отбираемые у половозрелых или почти половозрелых карпов гипофизы и консервируют последние . Нативные гормоны другого

происхождения не принесли однознач- Hoi o положительного результата.

Г ипофиз карпов применяют при размножении многочисленных видов рыб.

51

Исключение составляют чуждые карпо- вым по систематике рыбы, например осетровые, для стимуляции которых используют гипофизы этих же видов рыб. Гипофизы берут у половозрелых рыб, обезвоживают их с помощью ацетона и высушивают при комнатной температуре в течение 24 ч, затем размельчают в ступке и растворяют в физиологическом растворе.

Полученный раствор инъецируют в мышечную ткань рыб, а у маленьких рыб и у рыб с более рыхлым мясом инъекцию проводят в брюшную полость

Способ гипофизарных инъекций дает хорошие результаты не во всех случаях. Основная причина этого заключается в том, что не всегда известно, в каком состоянии зрелости находятся рыбы, у которых отбирают гипофизы, поэтому неизвестно и количество содержащихся в них гонадотро- пинов. Гормоны гипофиза карпов действуют только на карпов и на генетически близких к ним по виду рыб, поэтому многочисленные экономически важные виды рыб вообще не могут размножаться с помощью инъекций гипофиза или размножаются с незначительной эффективностью.

С помощью гипофизов при условии размножения в большом масштабе достигнуто в настоящее время только LH-действие, FSH-действие нереализуемо по причине, указанной вьш1е (неизвестно, в каком состоянии поло возрелости находятся рыбы, у которых берут гипофизы).

Недостаток FSH-действия позволяет применять гипофизирование только для индукции рыб с овуляционно зрелой икрой.

Кроме того, возможность индуцированного искусственного размножения при использовании гипофиза ограничена отрезком времени, составляющим естественный период нереста, что ведет к ограниченному использованию производственной мощности.

Получение гипофизов у рыб связано с уничт эжением потенциально очень ценных и имеющихся в ограниченном количестве производителей, что также является недостатком известного способа.

Известно использование для получения половых продуктов рыб других соединений, обладающих гормональным

19522

действием и являющихся синтетическими лналогами LH/RH-гормонов. Однако получаемые при их использовании ик5 ;

10

.ринки окружены фолликулярной оболочкой, которая препятствует их оплодотворению и получению нового потомства. Область применения этого способа ограничена карповыми рыбами и и лососем.

0

0

Целью изобретения является улучшение качества полученных половых продуктов и возможность их получения у рыб различных видов.

5 Поставленная цель достигается путем введения в организм половозрелой рыбы новых производных гона- долиберина, так как известно, что выделенные в гипоталамусе рыб гона0 дотропины FSH - LH/RH успешно заменяются указанными соединениями. Инъецирование этими соединениями вызывает развитие спермы и икры, а также овуляц1те).

5 Сущность способа получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года состоит в том, что у рыб исследуют половые продукты д икру и сперму и п6 их состоянию устанавливают биологическую зрелость рыб.

Овуляционно зрельпс рыб отбирают, отделяя их от незрелых, и вводят им путем инъекции соединение с гормональным действием, представляющее собой нонапептид С : 4 ал к ил амиды или декапептидамиды общей формулы

Clp-His-Trp-Ser-Tyr-X, -X -Xj-Pro-X,

где X, -.D-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu,

D-Ser;

Xj - Trp, Phe, или Leu; Xj - Gin или Leu; - X. - GlyNH2 или С,.4-алкил NH.

Рыбам могут быть введены также соли этих соединений.

Соединение вводят рыбам последовательно дозами, количество которых составляет от 2 до 15.

Величина дозы, устанавливаемая в зависимости от вида соединения, составляет от 0,1 до 500 мкг/кг веса тела рыбы, при этом величина последней дозы равна величине предьщущей

5 или превьш1ает ее в 1,5 раза.

I

Поскольку используемые соеднне- ния нетоксичны, то превьш1ение дозы не наносит никакого вреда.

При обработке рыб число инъекций в клждом случае зависит от того, насколько данная рыба подготовлена к икрометанию: чем ближе это состояние, тем меньше доз препарата ей следует вводить.

После введения инъекций у рыб отбирают половые продукты, например, путем сцеживания, причем рыба считается созревшей в том случае, если у самцов сперма активизируется тотчас же после соприкосновения С водой, а у самок - если клеточное ядро яйце.клетки находится в непосредственной близости от оболочки яйца. Отобранные половые продукты используют при искусственном рыборазведении.

Применяемые согласно описываемому способу соединения получают с помощью обр;епринятьгх методов синтеза пептидов в твердой фазе.

В зависимости от структуры желательного соединения в случае пепти- далкиламидов исходят из хлорметили- рованных полистиролдивинилбензоль- ньк смол, в случае амидов пептидных кислот - из беизгидриламинных смол

Отдельные аминокислоты в форме их N-n-бутилоксикарбонильных производных могут постепенно соединяться со смолой с помощью дициклогексилкар бодиимида, или диизопропилкарбодними да, или с помощью соединения через активные сложные эфиры.

Целевой продукт можно удалять с твердого носителя путем кислотного или щелочного отщепления. В зависимости от химического характера изменяемых частей аминокислот соединени общей формулы могут быть получены также путем соответствующих комбинаций постепенной (ступенчатой) кондесации ифрагментной конденсации из известных в настоящее время аминокислот

Описываемый способ обладает сле- дуюп1ими преимуществами:

позволяет проводить искусственное размножение рыб, генетически чуждых карпам, которых до сих пор н удавалось размножать из-за отсутствия специфических гипофизов рыб и их синтетических аналогов;

может быть применен в широких биологических границах окружающей среды, так как соединения общей формулы оказывают свое действие при различных биологических условиях;

5

0

5

0

5

0

5

0

5

позволяет более полно использовать Производственные мощности.

Действие препаратов, используемых при ос тцествлении способа, совпадает с действием собственных гона- дотропинов рыб, причем эти препараты интерспецифичны, т.е. активны в случае генетически чуждых одни другим рыб.

Пример 1. Проводят искусственное размножение осетра (Acipenser ruthenus). Для этого из популяции рыб данного местообитания отбирают половозрелых рыб и транспортируют на станцию для размножения. Рыб сортируют по полу, затем определяют сте- пекъ зрелости икры (яйцеклеток самок) , относя к зрелым те из них, у которых клеточные ядра яйцеклеток находятся на периферии. Степень зрелости самцов не определяют, так как в популяции рыб данного местообитания половые продукты самцов и самок находятся практически в идентичном состоянии.

Рыбам, котовым к овуляции (самцам и самкам), вводят путем инъекции декапептид формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu- Gln-Pro-Gly-NHj в одноразовой дозе 70 мкг/рыба.

Если рыбы не созрели для овуляции, то их выдерживают при естественной температуре нереста, вводят соединения последовательно, двукратно, самое большее десятикратно, дозами по 10 мкг указанного соединения до тех пор, пока клеточные ядра не переместятся от центра к периферии; число обработок зависит от степени зрелости рыб.

Процесс созревания протекает при 15°С 100-650 градусодней.

Спустя 28 ч после введения- последней дозы происходит овуляция, а в последующие 50 мин получают половые продукты рыб.

П р и м е р 2. Индуцируют нерест карпа (Cyprinus carpio Z).

В любое время года и при любой температуре воды отбирают из популяции половозрелых рыб, которых транспортируют для размножения на станцию. Рыб разделяют по полу и определяют состояние зрелости, как в примере 1. Если рыбы зрелые, то самкам и самцам вводят декапептид формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Trp- .eu-Pro-Gly NH . He созревших для овуляц11и рыб выдерживают при естесвенной температуре нереста и обраба тывают по крайней мере двукратно ил (самое большее) пятнадцатикратно указанным соединением в дозах по 5 мкг/рыба.

Процесс созревания при 22°С зани мает от 100 до 750 градусодней.

Через 250 градусодней после введния последней дозы происходит овуляция. В течение 50 мин у рыб отцеживают половые продукты.

П р и м е р 3. Осуществляют индуцирование нереста у окуней (Регса fluviatilis), для чего рыб отбирают так же, как в примере 1, а затем обрабатывают, самцов и самок декапепти дом формулы Glp-His-Trp-Ser-D-Phe- Leu-Gln-Pro-Gly NH в разовой дозе 20 мкг/рыба.

Несозревших рыб выдерживают при температуре нереста и обрабатывают по крайней мере двукратно или десятикратно, вводя указанное соединение в дозе 2 мкг/рыба. Процесс созревания при занимает от 100 до 400 градусоденй. Спустя 30 ч после введения последней дозы происходит икрометание. Окуни выметывают икру в бассейнах сами, что исключает от- цеживание половых продуктов.

П р и м е р 4. Проводят искусственное размножение макрели (Trachu- rus trachurus), для чего из пойманных в ноябре месяце адриатических макрелей отбирают экземпляры длиной 24 см и транспортируют на станцию для размножения. Рыбы упомянутого размера являются половозрелыми.

Кождой рыбе вводят путем инъекци разовую дозу (10 мкг) соединения формулы Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe- Leu-Gln-Pro-Gly NH.

При температуре 21°С происходит овуляция в течение 24 ч.

В течение 2 ч проводят отцежива- ние половых продуктов.

П р и м е р 5. Проводят индуцированное размножение щук (Esox lucius)

Рыб отбирают из популяции, транспортируют, разделяют по полу, как в примере 1. Созревшим для овуляции рыбам вводят такое же соединение с гормональными свойствами, как в примере 4.. ,

5

0

5

г

)Q

0

с

0

5

0

5

Соелиненпе т поцят двукратно, са- Mfie большее 10-кратно п дозе по 5 мкг/рыба.

С)(1тревание рыб при 1 1 С занимает от 70 до 350 градусодней. Спустя 39ч после введения последней дозы происходит овуляция. В б.пюкайшие 5 ч отцеживают половые продукты.

П р и м е р 6. Проводят индуцированный нерест толстолобика (Нуро- phalnychtys molitrix).

В отличие от примера 1, созревшим рыбам вводят декапептид Glp- Нл s-Trp-Ser-Tyr-D-Plie-Trp-Leu-Pro- Gly-Nli,, в одноразовой дозе 100 мкг/ /рыба. Не созревших для овуляции рыб выдерживают при естественной температуре нереста и обрабатывают от 2 до 15 раз (в зависимости от степени зрелости) указанным соединением, которое вводят в дозе 10 мкг/рыба. При этом величина последней дозы составляет 15 мкг/рыба. Процесс созревания при 23 С занимает от 150 до 850 градусодней. Спустя 250 градусодней после введения последней дозы происходит овуляция . Затем половые продукты сцеживают.

Дальнейшие примеры осуществления способа с использованием соединения обн1ей формулы приведены в табл.1 с указанием доз, которые необходимо ввести для получения требуемого результата.

В таблице указаны только изменен ные члены аминокислот в соединении общей формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X -X -X,- Рго-Х.

Согласно примерам, приведенным в табл.1, опыты проводили со стерлядью. Для каждой дозы и каждого соединения испопьзовали 10 рыб. В таблице приведены данные показывающие в процентах количество рыб, которые овулировали после введения им соединения с гормональным действием. 1

Соединения, приведенные в табл.1 под №№ 1, 4 и 5,очищены хроматогра- фически, поэтому в данных примерах способ осуществляется с использованием солей 3Tifx соединений.

Из таблицы видно, что каждое соединение действует в специфичных для него дозах, лежащих в пределах от 0,1 до 500,0 мкг/рыба.

В табл.2 приведены физико-химические константы соединений, используемых для осуществления способа.

Формула изобретения

Способ получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года, предусматривающий определение биологической зрелости рыб путем исследования их половых продуктов, отделение овуляционно незрелых рыб от зрелых, введение зрелым рыбам путем инъекции соединения с гормональньм действием и сбор полученных после инъекции половых продуктов, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества полученных половых продуктов и возможности их получения у рыб различных видов, в качестве соединения с гормональным действием рыбам вводят нонапептид - С -С -алкиламиды или декапептидамиды общей формулы

X

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X, -Рго

4

где

X,- D-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu, D-Ser;

Xj - Trp, Phe, Leu;

Xj,- Gin или Leu;

Gly NHi или С -С -алкил NH, или их соли, соединения вводят пос- |ледовательно дозами, количество которых составляет 2 - 15, величину доз устанавливгиот в соответствии с данными,приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или пре- вьппает ее в 1,5 раза.

Таблица 1

IZZI

Тгр Leu des Gly

5D-Phe Gln des Gly ° GnRH-этиламид

6КЬе Leu GnRH

7 Phe Gln GnRH

8Trp Gin des Gly GnRH-этиламйд

9D-Trp Leu® GnRH

10D-ala Gln GnRH

11D-Leu Gin GnRH

12О-трет-бут-D-Ser - G In -GnRH

167-164 -5,9 0,5 0,1 H. уксусная

кислота

181-183 -10,2 1,0 10%-ная уксусная

кислота 175-178 -19,0 0,1 0,1 н. уксусная

кислота 182 -21,0 0,1 0,1 н. уксусная

кислота 179-180 -29,0 0,1 0,1 н, уксусная

кислота 168-170 -15,5 0,1 0,1 н, уксусная

кислота 182 -32,3 1,0 0,1 н. уксусная

кислота 183-185 -35,0 1,0 0,1 н. уксусная

кислота 178-179 -23,0 1,0 0,1 н. уксусная

кислота

Составитель С.Филиппова Редактор А.Маковская Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 6615/59

Тираж 470

В11ИИПИ Государственного по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Г

Продолжение табл. 2 5

0,69 0,55 0,57 0,63

Подписное