Способ получения производных гонадолиберина Советский патент 1988 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

см

Изобретение относится к способу получения производных гонадолибери- на - новых биологически активных соединений, которые могут найти примене- ние в рыбоводстве.

Цель изобретения - способ получения новых производных гонадолибери- на - малотоксичных и значительно по- вьтающих способность к овуляции и спермиации стерляди.

Производные гонадолиберина получают, используя метод синтеза пептидов в твердой фазе,

За ходом реакций следят с помоп ю теста с нингидрином. При обнаружении свободных аминогрупп ацилирование повторяют. В зависимости от природы аминокислоты продолжительность про- цесса связывания составляет 1 - 16 ч.

Отщепление защитных групп и отделение пептида от смолы осуществляют с помощью жидкого безводного фтористого водорода в одну стадию. При при- менении N -динитрофенила удаляют защитные группы еще до отщепления смолы с помощью HF-отщепления. Защищенную пептидную смолу перемешивают в содержащем пропил амин диметилформамида и после удаления растворителя обрабатывают обычным образом с помощью HF. Если полученное соединение является пептидалкиламидом, то пептид отделяют от смолы путем алкиламмонолиза и за- тем в зависимости от характера защитных групп каталитически гидрируют и/или гидролизуют кислотой.

Сырой продукт чистят путем гель- фильтрации на Сефадексе G 25, элюирование ведут с помощью уксусно-кислых растворов.

Для дальнейшей очистки использую HPhC-колонки жидкостная хроматография высокого давления и/или хрома- тографию на силикагеле. Чистоту пептидов исследуют путем аминокислотного анализа и посредством тонкослойной хроматографии. R f- значения тонкослойной хроматографии определяют на силикареле (тонкая алюминиевая фольга) . Merk с помощью следующих смесей растворителей:

Этилацетат:пиридин:уксусная кисло- та:вода 30:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусная кисло- та:вода 60:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусная кисло- та:вода 120:.20:6: 11

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода 2АО:20:6:11

н-Бутанол:уксусная кислота:вода: :этилацетат 1:1:1:1

н-Бутанол:уксусная кислота:вода

4:1:1

Изопропанол:1 М уксусная кислота 2:1

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода 5:5:1:3

нтБутанол:уксусная кислота:аммиак концентрированный аммиак и вода 1; };вода 6:1:1:2

Метилэтилкетон:уксусная кислота: :вода 125:15:20

Пример 1. D- Phe, Gin - гонадолиберин (М:1243)

а). Синтез.

1,25 г (1 ммоль) бензгидриламино- гидрохлоридной смолы (0,8 ммоль/г Pierce) в течение 2 ч оставляют набухать в дихлорметане. При ацилирова- нии с помощью аминокислот, смотря по обстоятельствам, повторяют следующий цикл: (см. табл.1).

После последней стадии вес Glp- HislTos|-Trp-Ser|OBZlf-Tyr I OBZll-D- Phe-Leu-Gln-Pro-Gly - пептидной смол составляет 2,28 г. dW:1,05 г (66%). М (gesch.) полученного пептида:1577.

б), Отщепление с помощью HF.

К смоле добавляют 3 мл анизола и 100 мг дитиотрейта (Dithiothrit), затем конденсируют в смеси 30 мл HF. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 0°С. Затем фторисный водород удаляют в токе азота, остаток суспендируют в абсолютном эфире и затем отфильтровывают. Твердый остаток промьтают 50%-ной уксусной кислотой. Фильтрат выпаривают при . Остаток подают непосредственно на гель-хроматографию.

в). Гель-хроматография.

Полученное согласно предыдущему пункту вещество очищается на колонке с Сефадексом G 25 (2,5x100 см) с помощью уксусной кислоты в качестве элюирующей кислоты. Элюирование осуществляется с помощью абсорбции УФ- света при длине волны 280 нм, а такж посредством тонкослойной хроматографии. Скорость элюирования составляет 15 Мл/ч. Собирают фракции между 300м и 350 мл и лиофилизируют. Вес 690 мг (55%).

г). Препаративная жидкостная хроматография высокого давления,

3

Используется препаративная HPLC- колонка (колонка для жидкостной хроматографии высокого давления) размером 2, см (С,5-силикагель .LRP-1, 13-24 мик. Ватман). Она уравновешена смесью 25% метанола с 75% 30%-ной уксусной кислоты. После установления равновесия на колонку наносят 230 мг очищенного с помощью гель-хроматогра фии вещества, растворенного в той смеси растворителей. ЭЛюируют с помощью градиента метанол(уксусная кислота, состав которого линейно изменяется между 25% метанола 75% 30%-ной уксусной кислоты и 40% метанола) и 60% 30%-ной уксусной кислоты.

Скорость элюирования составляет 2 мл/мин, давление 3,5-10 Па. Фракции детектируют с помощью УФ-света с длиной волны 280 нм, их содержание контролируется с помощью тонкослойно хроматографии. Вес чистого целевого продукта D - Phe, Gin - GnRH после лиофшшзации составляет 133 мг. Это соответствует в расчете на общее количество вещества 399 мг (32%) ощищенного целевого продукта. ,76; ,6bi ,33; ,93; ,83, Т.ПЛ. 175 - , - 68,0 (C

1,00;

0,1, 0,1 H CHjCOOH).

Аминокислотный анализ: Gly : 1,02; Pro : 0,95; Leu Phe : 1,02; Tyr : 1,01; Ser : 0,93; His :: 0,99; Glu:1,96. Т.ПЛ. 175 - 178°C, c j -68 (c 0,1, 0,1 CHjCOOH).

П p и M e p 2. Trp, Gln - гона- долиберин. (М:1226).

a). Синтез.

Исходя из 2,5 г (1 ммоль) бензгид риламиногидрохлоридной смолы (О,Л.мол эквивалент/г) описанным в примере 1 в п.а) образом получается пептидная смола Glp-HisiDNPl-Trp-SerlO-BZI I Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly - смола. Вес пептидной смолы составляет 3,62 г; ,12 г (76%).

(М полученного пептида: 1468).

б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы. Отщепление динитрофенильной защитной группы (DNP)..

Пептидную смолу в течение 1 ч при комнатной температуре перемешивают в смеси 20 мл диметилформамида с 1 мл пропиламина. Затем смолу отфильтровывают и промывают дихлорме- таном, затем - зтанолом.

ю

3969704

Расщепление с помощью HF.

После удаления динитрофенильной защитной группы описанным в примере 1 в п. б) образом отделяют пептид от смолы, а защитные группы - от пептида. По окончании обеих стадий остаются 0,8 г (65%) вещества,

г). Гель-хроматография.

Работают указанным в примере 1 в п.в) образом. Вес собранных и лиофи- лизированных фракций составляет 520 мг (42%).

д) Препаративная жидкостная хрома- 15 тография высокого давления.

Работают указанным в примере 1 в п.г) образом с тем отличием, что уравновешивание осуществляется с помощью смеси из 18% метанола и 82% 20 30%-ной уксусной кислоты. Очищенное с помощью гель-хроматографии вещество элюируется из колонны с помощью смеси метенол/уксусная кислота, состав которой линейно изменяется между 18% 25 метанола (82% 30%-ной уксусной кислоты и 35% метанола) и 65% 30%-ной уксусной кислоты. Фракционирование, а также прочие условия совпадают с та- ковьп и примера 1 п.г). Вес лиофилизй- рованного целевого продукта составляет 380 мг (31%) ,66; ,57-,

30

го

. 12,0

35

,78j т.гш. 160 С (С 0,1; 0,1 Н CHjCOOH).

-Аминокислотный анализ: Glu : 1,93; Gly : 2,04; Pro : 1,00; ,98; Ser : 0,93; .Trp : 1,86; His 1,03.

П p и M e p 3. Trp , Leu , des Gly NH гонадодиберин-зтиламид ( 1198).

a). Синтез.

В качестве первой стадии синтеза БОК-Рг известным способом связывают с хлорметилированной полистирольной смолой. 2 г полученной таким образом БОК-Рг о-смолы (0,5 моль-зквивалент/ /г) в течение 2 ч оставляют набухать в дихлорметане и затем описанным в п.а) примера 1 образом постепенно . связывают со смолой соответствующие защищенные аминокислоты. После последнего цикла получают 3,02 г пептидной смолы Glp-HisIDNPf-Trp- Ser|OBZIf-TyrfOBZIf-Gly-Trp-Leu-Pro. 5 1,02 г (83%). (M полученного пепти- да: 1486).

б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы.

Сначала согласно п. б) примера 2 отделяют динитрофенильную защитную группу от гистидина.З&тем отщепляют пептид в форме этиламида от смолы. Для этой цели на защищенную пептидную смолу наконденсируют 15 мл этиламина и смесь перемешивают при 0 С в течение 3 ч. Избыток амина удаляют с помощью азота. После этого промывают метанолом, затем - диметилформамидом. ДМФ-раствор выпаривают и получающееся в качестве остатка после выпаривания масло растирают с эфиром. Осадок отфильтровывают.

Полученное таким образом твердое вещество с целью удаления защитных групп обрабатывают согласно п.б) примера 1, газообразным фтороводородом. Получают 71,0 мл (59%) нонапептид- этиламида.

г). Гель-хроматография.

Работают описаннным в п. в) примера 1 способом с колонкой из Сефадекса

гель LRP-1 уравновешивается с помо содержащего 10% метанола и 20% укс ной кислоты водного раствора. Элюи ют с помощью линейного градиента,

G 25 и в качестве элюирующего средст-25 торый содержит в 20%-ной уксусной

I OBZI 1-ТугIOBZI -Gly-Phe-Gln-Pro-Gly- смола (3W: 1,27 г (83%). М полученного пептида 1521.

б). Отщепление защитных групп.

Защищенный пептид описанным в примере 1 п.б) образом обрабатывают безводным HF. Получают 980 мг (82%) незащищенного пептида.

в). Гель-фильтрация.

Сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищают на заполненной Сефадексом G - 25 колонке с помощью 2М уксусной кислоты.

Выход: 576 мг (49%).

г) . Препаративная FlPL-хроматогра- фия (жидкостная хроматография высокого давления).

Работают описанным в примере 1 п. г)

образом с тем различием, что

гель LRP-1 уравновешивается с помощью содержащего 10% метанола и 20% уксусной кислоты водного раствора. Элюиру- ют с помощью линейного градиента, ко

Изобретение относится к пептидам, в частности к получению производных гонадолиберина формулы I: Gep- HiS-Trp-Ser-Tyr-X -Xj-Xj-Pro-Gly NHCjH, где Х - Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет.бутил DSer; Xg - Leu, Trp, Phe, Gin; X, - Gin, Leu. Цель - разработка способа получения новых соединений, повышающих способность к овуляции и спермиации стерляди. Получение целевых соединений ведут построением пептидной цепи твердофазным методом исходя из глицина и бенэгидриламингидрохлоридной смолы. К полученному глицилполимеру присоединяют соответствующим образом защищенные аминокислоты в последовательности, обусловленной пептидом формулы I с использованием карбодиимидного метода или метода активированных эфи- ров. От полученного при этом пепти- дил-полимера формулы II: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-Xj-Xj-Pro-Gly-W. Y Y Y где Y - динитрофенил или тозил; Y - OBZl; W - бензгидриламин, отщепляют защитные группы и полимерную подложку. Испытания показывают, что указанные соединения способствуют овуляции рыб. 4 табл. i СО 00 со Од СО vj

ва используют 30%-ную уксусную кислоту. Вес собранных и лиофилизированны фракций составляет 490 мг (41%).

Сырой пептид очищают далее на колонке с силикагелем 60 (230-400 мещ. Merck) размером см. Элюируют смесью этилацетата с пиридином, уксусной кислотой и водой в соотнощени 30:20:6:11. гГроточная скорость составляет 3 мл/ч. Фракции по 4 мл собирают (улавливают) и за элюированием следят с помощью тонкослойной хроматографии.

Соответствующие гонадолиберинэтил амиду Тгр LCU des Gly NH 5 фракции определяются на основании аминокис-i. лотного анализа. Получают 320 мг (26%) лиофилизированного материала. Т.пл. 167 - 174°С, o/JiJ - 5,9 (С 0,5i 0,1 Н CHjCOGH) ,6li К 0,42-, ,75.

Аминокислотьй Gly : 0,96; Gly Ley : 1,00; Ser Trp : 1 ,88; His

П p .И M e p 4

анализ; . 0,97;

Pro

0,95-,

1,02;

0,89; Туг

1,03.

Phe, Gin Гонадо

либерин ().

a). Синтез. 1,25 г (1 ммоль) бенз- гидриламиногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г) оставляют на- gg бухать в течение 2 ч в дихлорметане. Из набухшей смолы описанным в примере 1 п.а) образом получают 2,9 г пептидной смолы Glp-His|Tos|-Trp-Ser

0

0 His

1,03-,

1,00;

182 C.

Pro

Phe ; Т.ПЛ, Leu Гонадоg

кислоте количество метанола от 10% с возрастанием вплоть до 25% (2 150 мл). Затем продолжают элюирова- ние с помощью содержащего метнол в возрастающем количестве от 25 до 40%, линейного градиента ( мл). Полученные фракции чистого пептида собирают и выпаривают. Выход: 448 мг (38%), Т.пл. 182 С; 21,0 (С 5 0,1, 0,.1 Н CHjCGOH) .

,12; ,7; ,24; ,87,

Аминокислотый анализ: Ser ; 0,85; Glu : 2,05; Gly : 2,13; Tyr : 0,92; 0,95; Trp : 0,81.

П p и M e p 5. Phe, либерин (M:1172).

a). Синтез.

0,62 г (0,5 ммоль) бензгиДрилами- 5 ногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г) оставляют набухать в течение 2 ч в дихлорметане. Затем описанным в примере 1 п.а) образом получают пептидную смолу: Glp-HislTos| Trp-SerlOBZIL -Typ-IOBZI l-Gly Phe-Leu- Pro-Gly - смолу.

Выход: 1,33 г aW: 695 мг (92%). M полученного пептида: 1506.

б). Обработка с помощью HF.

Защищенный пептид обрабатывают безводным HF описанным в примере 1 п.б) образом. Получают 510 мг (87%) сырого декапептида.

в). Гель-фильтрация.

0

Полученный согласно стадии б) сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищается на колонке с Сефадексом G-25 с помощью 2М уксусной кислоты. Выход: 363 мг (62%)

г).Хроматография на силикагеле.

Для дальнейшей очистки пептида служит заполненная силикагелем 60 колонка размером 2x100 см, которая элю- ируется приготовленной в соотношении 1:1:1:1 смесью из н-бутанола, уксусной кислоты, воды и этилацетата. Содержание фракций контролируется УФ- спектрально, а также с помощью тонкослойной хроматографии. ..Получают 299 мг (51%) чистого декапептидамида. Т.пл. , «хЗ ц- 19,0 (,1i 0,1 Н CHjCOOH). ,55i ,39; ,62; ,73,

Аминокислотньй анализ: Ser:0,91; Gln:0,97; Pro:1,07; Gly: :2,12; Leu:1,00; Туг:1,03; РЬе:0,94; His:1,05.

В условиях способа, описанного в примере 1, получены-соединения согласно табл.2 и 3 (примеры 6-9).

Проведены биологические испытания производных гонадолиберина, полученных в условиях предлагаемого способа.

Производные гонадолиберина вводились рыбам (стерлядь Acipenser Suthe- mis) путем внутримышечной или подкожной иньекции в дозах 0,1 мкг - 5 мг на 1 кг веса (см. табл.4).

Проведенные испытания показали, что аналоги гонадолиберина в указанном интервале доз способствуют овуляции рыб (стерлядь Acipenser Suthemis) в то время как известное соединение D-Ala des С1у СпК-этиламид в указанном интервале доз не оказывает воздействие на способность этих рыб к размножению.

Формулаизобретения

Способ получения производных гонадолиберина общей формулы I: Gep-His- Trp-Ser-Tyr-Xi-X j-Xj-Pro-Gly , где X, - Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет-бутил;

X, - Leu, Trp, Phe, GIN;

X 3 - Gin, Leu,

отличающийся тем, что, построение пептидной цепи осуществляют твердофазным методом, исходя из глицина и бензгидриламингидрохлорид- ной смолы, с последующим присоедине

нием к полученному глицилполимеру соответствующим образом защищенных аминокислот в последовательности, обус- ловленной пептидом общей формулы I с использованием кapбoдии иднoгo метода или метода активированных эфи- ров, и от полученного при этом пеп- тидил-полимера формулы II

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-X ,j-X j-Pro-Gly-W,

Y Y Y где Y - динитрофенил или тозил;

Y - OBZl;

W - бензгидриламин, отщепляют защитные группы и полимерную подложку.

20

10

Т а б л и ц а 1

25

30

35

0

5

0

5

этиламина и 90% CHClj, промывка 2-кратная 2

7CHClj, промывка 2- кратная1

8Этанол, промывка 2-кратная1

9CHjCl, промьшка 2-кратная1

103 ммоля БОК-аминокис- лоты, растворенные в дихлорметане и 3 ммо-

ля ДЦК или ДИК, раст-- 60 (позоренные в разному

11CH Clj, промывка 2-кратная1

12Этанол, промывка 2-кратная1

При связывании Gin с помощью метода активного сложного эфира связывается через БОК-GIn-CNP; в случае пироглутаминовой кислоты работают без защитной группы.

1396970

6 D-TrpS Phe , Leu -GnRH 168-170 7 D-Ala , Gln« - GnRH 182

8 D-Leu Gin -GnRH 183-185

9 0-трет.бутил-В Зег - 178-179 -Gin -GnRH

IТаблицаЗ

Аминокислотный анализ соединений, соответствующих примерам 9-12

60,871,011,121,04

70,911,900,951,10. 1,07

80,972,011,071,00

91,871,981,051,07

j.Таблица4

Число овулированных рыб, %, под действием соединений по изобретению на стерлядь (Acipenser Suthemis)

10 10 30 30

50 60 90

Таблица2

0,1 0,1 H. 0,69 3.2 уксусная кислота

1,0 0,1 н. 0,55 43

уксусная

кислота 1,0 0,1 н. 0,57 47

уксусная кислота 1,0 0,1 н. 0,63 37

уксусная

кислота

1,000,920,951,021,87

1,001,02 -0,950,92

2,121,01 -0,930,91

1,000,96 -1,030,83

90

80

60

50.