Способ получения гибридных штаммов дрожжей SасенаGомYсеS ceReVISIae для сбраживания крахмала Советский патент 1989 года по МПК C12N1/18 C12N15/00 C12N1/18 C12R1/865 

Изобретение относится к хлебопекарной, спиртовой и пивоваренной про- мьшшенности, в частности касается технологического процесса, связанного с утилизацией крахмалсодержащего сырья с использованием пищевых дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Цель изобретения - получение штаммов, содержащих экспрессирующийся ген глюкоамилазы.

Способ заключается в том, что получают штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащие структурный ген глюкоамилазы и неактивный аллель со

о гветствуюп;его репрессора и способные использовать крахмал в качестве единственного источника углерода, секре- тируя глюкоамилазу в среду, с одновременным сбраживанием образующейся глюкозы. Предлагаемые штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae получены в результате нескольких этапов скрещивания дрожжей Saccharomyces diacta- ticus CBS 1782, секретирующих глгоко- амилазу, с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, из Петергофских генетических линий, ведущих ое происхож- цение и от расы S, cerevisiae XII, а также с дрожжами - сахаромицнтамн из Карбоьщайльских- ге-нетических линий. Предлагаемые штаммы дрожжей S, се.revisiae имеют следующие морфологи- ч еские и культуральные признаки.

Клетки имеют овальную, реже п очти круглую форму, средний размер 6,7 х

X. 5,0 мкм. Размножение почкованием.

;Через 96 ч инкубадаи на сусло-агаре образуют круглые колонии, диаметром 4,0 - 6,3 мм. Край колонии ровный или слегка исчерченньй, поверхность матовая. Дрожжи сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, рафинозу, крахмал; не сбраживают ксилозу и арабинозу. Желатину не разжижают, глицерин и спирт (этанол) усваивают. Не усваивают маннит, дуль- цит и сорбит.

Культуры из полученных генетических линий Бьфащивают в жидкой среде на качалке или на агаризованных средах, содержащих один из следующих источников углерода: глюкозу (2%), мальтозу (2%), сахарозу (2%) или этанол (1,5%), а также пептон (1%) и дрожжевой экстракт., (или дрожжевой автоли- зат) (0,5%) в качестве источника ростовых веществ. Выращенную биомассу

используют для посева в среду для брожения. Посевной титр составляет (О,5-5,0)-10 кл./мл. Среда для бро - женин имеет рН 5,0-6,0 и содержит клейстеризованньй крахмал (1,5-4,0%) или муку (4%). В случае использования

крахмала в состав среды вводят ростовые факторы - дрож кевой экстракт (0,5%) или дрожжевой автолизат (0,5%). Брожение проводят при 28 - 35°С в течение 48-96 ч..Процесс сбраживания контролируют по интенсивному вьщеле- Ш1Ю СО.

Способ поясняется конкретными при- черами.

17674

П р и м е р .1. Получение линий дрожжей S. cerevisiae осуществляют, в два этапа.

Этап 1. Генетические линии S. cerevisiae получают следующим образом.

Культуру клеток S. cerevisiae CBS 1782, секретирующую глюкоамилазу и имеющую генотип STA 2 sta 10 (STA 2 5

0

5

п

.Q

Q аллель, кодирую1ций глюкоамилазу, sta 7 10 - неактивньй аллель ген-репрессора глюкоамилазы), выращивают на полноценной среде с глюкозой в течение 48 ч. Далее с помощью микроманипулятора вьщеляют отдельные клетки, которые раскладывают на полноценной агаризованной сре,де, помещая к ним вег етативные клетки штамма S. cerevisiae № 117 генотипа sta 2 STA 10 (sta 2. - отсутствие структурных генов глюкоамилазы, STA 10 - ген-реп- рессор глюкоамилазы). Через 4 ч инкубации отбирают образовавшиеся зиготы и после этапа вегетативного размножения этих гибридов индуцируют у них спорообразование на ацетатной среде. Гибриды имеют низкие эффективность спорообразования и вьпкиваемость спор. Выжившие сегреганты среди споровых потомков, изолированных при тетрадном анализе, проверяют на способность к синтезу глюкоамилазы, что проявляется в виде зоны разложения крахмала вокруг колоний, растущих на чашках с питательной средой, содержащей крахмал (1:6%) и имеющей рН 5,4.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сегреганты имеют генотип STA 2 sta 10:ade 5. Далее с ними проводят пос- л едковат ел ьные бэккроссы на штамм S. cerevisiae № 134, который несет ауксо- трофную мутахщш в гене Сеп 2. При этом среди потомков каждый раз отбирают синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 sta 10. В третьем поколении были получены культуры, со- держап 1е структурньй ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в среде. Такие, культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с типовыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 93% и частотой выживаемости спор 84%. В результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единствен- ньй источник углерода.

5

0

5

5152

Пример 2. Этап 1. Получение линий осуществляют по примеру 1.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сег реганты имеют генотип STA 2 sta 10 ade 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм S. сеге- visiae № 1б40,который несет ауксотроф ную мутацию в гене t гр 1. При этом среди потомков каждьш раз отбирают синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 sta 10. В третьем поколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в среду. :Такие культуры хорощо скрещиваются как между собой, так и с типовыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 95% и частотой выживаемости спор 90%. В результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный источник углерода.

П р и м е р 3. Этап 1. Получение линий осуществляют по примеру 1.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сегреганты имеют генотип STA 2 sta 10 ade 5. Далее с ними проводят последо- ва- -ельнЫе бэккроссы на штамм S.uere- visiae № 193, который несет ауксртроф ную мутацию в гене ига 3. При этом, среди потомков каждый раз отбирают синтезируюидае глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 sta 10. Б третьем поколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в cpe ду. Такие культуры хорошо скре1цивают- ся как между собой, так и с.типовыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 90% и частотой выживаемости спор 66%. В результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный источник углерода.

Пример4. Определение активности глюкоамилазы.

У полученных культур S. cerevisiae определяют активность глюкоамилазы. Для этого клетки засевают в жидкую полноценную среду, содержащую растворимый крахмал (3%) и имеющую рН 5,4. Через 72 ч инкубации при осажда

Q 5 0 5

О Q 5 0

5

76

ют клетки и к 9 частям культуральной жидкости добавляют 1 ч раствора амилазы в диметилсульфоксиде (50 мг/мп) в качестве субстрата. В приготовленной таким образом реакционной смеси измеряют динамику накопления глюкозы с помощью глюкозооксидазопероксидазного реагента. Исходя из этой динамики рассчитывают активность глюкоамилазы в Стандартных единицах (мкмоль глюкозы/ /мл мин). Для разных культур полученной генетической линии активность составляет 0,03-0,05 ед. Контрольный ч щтамм S. cerevisiae XII активностью не обладает.

П р и м е р 5. Использование культур из полученных линий.

Набор культур 5-4А, 5-4В и 8-11C, относящихся к.созданным генетичес- :КИМ линиям, а также контрольный штамм S. cerevisiae.XII, используемый для сбраживания крахмала, выращивают в течение 48 ч на плотной питательной среде, содержащей глюкозу (2%), дрожжевой экстракт (0,5%) и пептон (1%). По истечении указанного срока клетки засевают в колбы с жидкой средой, содержащей крахмал (3%) и дрожжевой экстракт (0,5%) и имеющей рН 5,4. Посевной титр составляет 1-10 кл./мл. Засеянные колбы инкубируют при 30 С без аэрации для индукции брожения.

В таблице представлены результаты измерения титра клеток и характеристика брожения (по выделению СО) в динамике.

Из данных таблицы видно, что гибридные штаммы S. cerevisiae способны осуществлять процесс брожения, о чем говорит интенсивно возрастающее во времени выделение СОг, накапливать биомассу, используя крахмал, подвед- гающийся одновременному осахариванию глюкоам1-шазой, синтезируемой клетками. В то же время штамм S. cerevisiae XII, используемый в способе-прототипе, такой способностью не обладает.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить новые гибридные штаммы дрожжей S. cerevisiae, способные производить сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания амилолити- ческим ферментами. Это позволяет сократить расход осахаривающих ферментных коммерческих препаратов или солода, а также исключить технологичесKHir этап предварительного осахарива- ния .

Формула изобретения

Способ получения гибридных штаммов дрожлсей Saccharomyces cerevisiae /ViH сбраживания крахмала, предусмат™ риваю1ций скрещивание штамма Saccharomyces diastaticus CBS 1782} несущего структурный ген глюкоамилазы8 и штамма Saccharomyces cerevisiae, несущего ген-репрессор глюкоамилазы, отличающийся тем, что, с

целью повышения штаммов, содержащих экспрессируюп1Ийся ген глюкоамилазы,, полученный в результате скрещивания, гибрид переносят на питательную среду, содержаизую ацетат натрия, для индукции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизировать крахмал, и скрещивают их со штаммом Saccharomyces cerevisiae, HecynijiM маркер ауксотрофности, далее операции повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%.

Изобретение относится к хлебопекарной, спиртовой и пивоваренной промышленности, в частности к технологическим процессам, связанным с утилизацией крахмалсодержащего сырья. Целью изобретения является получение штаммов, содержащих экспрессирующийся ген глюкоамилазы. Способ получения гибридных штаммов дрожжей сбраживания крахмалсодержащего сырья заключается в создании гибридов дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE, которые содержат гены, годирующие глюкоамилазу, и способны секретировать этот фермент в культуральную жидкость. С помощью способа достигается интенсивное сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания коммерческими амилолитическими ферментами или солодом. Гибриды получают путем скрещивания штамма SACCHAROMYCES DIASTATICUS CBS 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штамма SACCHAROMYCES CEREVISIAE, несущего ген-репрессор глюкоамилазы. Затем гибриды переносят на питательную среду, содержащую ацетат натрия, для индукции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизировать крахмал, и скрещивают их со штаммом SACCHAROMYCES CEREVISIAE, несущим маркер ауксотрофности. Далее операции повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%. 1 табл.

(без предварительногоосахаривания крахмала)