Винный полиплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae I-328-4 ВКПМ Y-5031 Российский патент 2023 года по МПК C12N1/19 C12N15/81 

Изобретение относится к винодельческой промышленности и может быть использовано в качестве платформы для создания новых перспективных винодельческих штаммов методами генной инженерии.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются традиционным микроорганизмом, применяемым в виноделии. Как правило, в промышленных условиях используют специальные штаммы, обладающие более высокой продуктивностью и надежностью при ферментации по сравнению с лабораторными штаммами. Для получения модифицированных вариантов промышленных штаммов можно использовать различные приемы. Одним из перспективных подходов для эффективной геномной инженерии дрожжей является применение методик CRISPR/Cas9 [Rainha J, Rodrigues JL, Rodrigues LR. CRISPR-Cas9: A Powerful Tool to Efficiently Engineer Saccharomyces cerevisiae. Life (Basel). 2020 Dec 26;11(1):13. doi: 10.3390/life11010013. PMID: 33375364; PMCID: PMC7823794, Cai G, Lin Z, Shi S. Development and expansion of the CRISPR/Cas9 toolboxes for powerful genome engineering in yeast. Enzyme Microb Technol. 2022 Sep;159:110056. doi: 10.1016/j.enzmictec.2022.110056. Epub 2022 May 7. PMID: 35561628]. Необходимую модификацию генома можно получить путем направленного введения двухцепочечного разрыва в определенный участок хромосомы и его репарации in vivo за счет искусственно полученного донорного фрагмента ДНК с заданной последовательностью.

Важной особенностью промышленных штаммов дрожжей является то, что они, как правило, представляют собой полиплоидные штаммы. Последнее обстоятельство может существенно усложнять проведение генно-инженерной модификации таких штаммов, поскольку из-за наличия нескольких хромосомных копий труднее отбирать варианты, несущие требуемое генетическое изменение во всех этих копиях. Например, сообщалось о нарушении одного гена с эффективностью от 15% до 60% у полиплоидного промышленного штамма дрожжей ATCC 4124 по сравнению с почти 100% эффективностью у лабораторных гаплоидных аналогов [Zhang GC, Kong II, Kim H, Liu JJ, Cate JH, Jin YS. Construction of a quadruple auxotrophic mutant of an industrial polyploid saccharomyces cerevisiae strain by using RNA-guided Cas9 nuclease. Appl Environ Microbiol. 2014 Dec;80(24):7694-701. doi: 10.1128/AEM.02310-14. Epub 2014 Oct 3. PMID: 25281382; PMCID: PMC4249234.]. Поэтому в случае полиплоидных штаммов повышение эффективности отбора вариантов, характеризующихся присутствием заданной мутантной аллели в гомозиготном статусе, является актуальной задачей. В частности, для ее решения было предложено два взаимосвязанных подхода, один из которых состоял в усовершенствовании системы CRISPR/Cas9 за счет увеличения копийности плазмиды, экспрессирующей gRNA [Lian J, Jin R, Zhao H. Construction of plasmids with tunable copy numbers in Saccharomyces cerevisiae and their applications in pathway optimization and multiplex genome integration. Biotechnol Bioeng. 2016 Nov;113(11):2462-73. doi: 10.1002/bit.26004. Epub 2016 Jun 3. PMID: 27159405.]. Другой подход включал получение различных ауксотрофных мутантов у полиплоидного штамма дрожжей S. cerevisiae ATCC 4124. Такие маркированные штаммы, несущие нулевые аллели генов URA3, LEU2, TRP1, HIS3 и ADE2 в гомозиготе, удобно использовать для введения дополнительных геномных модификаций при помощи системы CRISPR/Cas9, позволяющей отбирать трансформанты по восстановлению прототрофности [Lian J, Bao Z, Hu S, Zhao H. Engineered CRISPR/Cas9 system for multiplex genome engineering of polyploid industrial yeast strains. Biotechnol Bioeng. 2018 Jun;115(6):1630-1635. doi: 10.1002/bit.26569. Epub 2018 Mar 8. PMID: 29460422].

Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении ассортимента полиплоидных штаммов дрожжей Saccharomices cerevisiae.

Целью настоящей работы является получение винного полиплоидного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающего ауксотрофным фенотипом за счет нулевой аллели гена CAR1 в гомозиготе [Wu D, Li X, Shen C, Lu J, Chen J, Xie G. Decreased ethyl carbamate generation during Chinese rice wine fermentation by disruption of CAR1 in an industrial yeast strain. Int J Food Microbiol. 2014 Jun 16;180:19-23. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.04.007. Epub 2014 Apr 13. PMID: 24769164; Guo XW, Li YZ, Guo J, Wang Q, Huang SY, Chen YF, Du LP, Xiao DG. Reduced production of ethyl carbamate for wine fermentation by deleting CAR1 in Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 2016 May;43(5):671-9. doi: 10.1007/s10295-016-1737-7. Epub 2016 Jan 30. PMID: 26831650; Chin YW, Kang WK, Jang HW, Turner TL, Kim HJ. CAR1 deletion by CRISPR/Cas9 reduces formation of ethyl carbamate from ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 2016 Nov;43(11):1517-1525. doi: 10.1007/s10295-016-1831-x. Epub 2016 Aug 29. PMID: 27573438.]. Данный фенотип проявляется как неспособность дрожжей к росту на среде с аргинином в качестве единственного источника азота.

В качестве исходного был выбран промышленный полиплоидный штамм дрожжей Saccharomices cerevisiae, депонированный в коллекции микроорганизмов виноделия «Магарач» (КМВ «Магарач») под № I-328 [Коллекция микроорганизмов виноделия. Каталог культур / Танащук Т.Н., Кишковская С.А., Иванова Е.В., Скорикова Т.К. // Ялта: Всероссийский национальный научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия "Магарач" РАН" – 2016. – 252 с.]. Для мутагенеза использовали компоненты системы CRISPR/Cas9 для дрожжей, описанной в протоколе https://www.benchling.com/blog/quick-and-easy-crispr-engineering-in-saccharomyces-cerevisiae, в частности, плазмиды pWS82 и pWS173. На основе pWS82 были сконструированы плазмиды, несущие так называемый спейсер, указывающий место разрезания гена CAR1 нуклеазой Cas9. Для этого пару праймеров Cr-Car1nD и Cr-Car1nR (см. табл.1) отжигали друг на друга, и полученный фрагмент ДНК клонировали в сайт Esp3I плазмиды pWS82, в результате чего получили плазмиду pWS82-CAR1-3. Аналогичную процедуру провели для другой пары праймеров: Cr-Car1mD и Cr-Car1mR, и получили плазмиду pWS82-CAR1-4.

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в работе.

Cr-Car1nD
Cr-Car1nR gactACTACTATCAAGATGGAAAC
aaacGTTTCCATCTTGATAGTAGT Cr-Car1mD
Cr-Car1mR gactGGGTTGAGAGATGTTGATGC
aaacGCATCAACATCTCTCAACCC Car_1F AACCGTGTAGGCAAAACTGGAC Car_2R1 atgatgatAGACAGTATGCGTAGCTTTACCA Car_3F1 tactgtctATCATCATCCCTTTTATCAAAATAAGCA Car_4R AGATGGCCGATTTGAGAGCCT

Донорный фрагмент ДНК для репарации двунитевого разрыва in vivo получали при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами. Для этого сначала амплифицировали ПЦР-фрагменты PCR4 и PCR5, используя геномную ДНК штамма I-328 в качестве матрицы. Амплификацию осуществляли с помощью полимеразы Phusion (Finnzymes Inc., MA 01801, США) с использованием соответствующих пар праймеров (см. табл. 2).

Таблица 2. Пары праймеров, использованных для амплификации ПЦР-фрагментов PCR4, PCR5 и PCR6.

ПЦР-фрагмент Пара праймеров Длина фрагмента PCR4 Car_1F / Car_2R1 220 н.п. PCR5 Car_3F1 / Car_4R 392 н.п. PCR6 Car_1F / Car_4R 612 н.п.

Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК использовали прибор Mastercycler Eppendorf AG 22331. После электрофореза в агарозном геле ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Clean-up system (Promega Corporation, WI 53711, США). В качестве матрицы для получения фрагмента PCR 6 использовали смесь фрагментов PCR4 и PCR5. Полученный в результате ПЦР-фрагмент PCR 6 выделяли из агарозного геля и использовали в качестве донорной ДНК для замены гена CAR1 на аллель сar1Δ в геноме штамма дрожжей I-328. Ниже приведена последовательность ПЦР-фрагмента PCR 6:

AACCGTGTAGGCAAAACTGGACCGCCCGTTAAGTTCTGCTATTAACAAATTAAATAAAATTGGCCAAACTGATGATTGACAGTTCTGAATATCCAAGATTACTGACTTCAATTTTCTCACTTCTCATCATAATATTCCGCTGATTTTTACATACCGTATATCCAATTTACGGCCCTTCACATATAGCGGCGAAATGATGGTAAAGCTACGCATACTGTCTATCATCATCCCTTTTATCAAAATAAGCATTCTCTTTTTATTTTAGTTAAGCACATGCATACATAAATTTACGAACAAAAAAAGAAAATAAATTAAAAATAAAAGTAGTGTATCTTCGTTACTTTTCATTCTTTTTGGTTAACCCACGTCTAATTGCCAATACACTATCGACGATCACGGCATCTACACCTGCTTCAATTTGTATACTGGCATTTTCGGGATCATTGTTGTCCACACCGTAAGTGACACATACCAGCCCATTAGACTTAACCACTTGCACCAACCGTGGGGCCTTTAAAATGGGTGCTGCAGCAGATACAATCCCCAATAAATTCCACTTCTTAGCAAATCTTATACCGTTTTGTAACGATGAGGCTCTCAAATCGGCCATCT

Для CRISPR/Cas9 трансформации были подготовлены следующие ДНК-фрагменты:

фр.1: EcoRV- EcoRV фрагмент pWS82-CAR1-3 (2046 н.п.),

фр.2: EcoRV- EcoRV фрагмент pWS82-CAR1-4 (2046 н.п.),

фр.3: Esp3I- Esp3I фрагмент pWS173 (10387 н.п.),

фр.4: ПЦР-фрагмент донорной ДНК Car1Δ.(612 н.п.).

Трансформацию штамма I-328 проводили, как описано в [Gietz RD & Woods RA (2002) Transformation of yeast by lithium acetate/single stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol 350, 87–96]. Вышеописанные фрагменты ДНК использовали в следующих соотношениях: фр.1/ фр.2 – 0, 1 мкг; фр.3 – 0,2 мкг и фр.4 – 1 мкг.

Трансформанты отбирали на чашках со стандартной полной средой YPD (пептон – 2%, дрожжевой экстракт – 1%, глюкоза – 2%, агар – 2,5%) с добавкой антибиотика G-418 (200 мкг/ мл среды). Отобранные клоны затем проверяли на способность роста на агаризованной среде SC+arg (YNB (без сульфата аммония) - 0,17%, глюкоза - 2%, аргинин - 0,3%, агар - 2,5%), в которой сульфат аммония заменен на аргинин в качестве единственного источника азота. Было отобрано 7 трансформантов, которые не обладали способностью роста на среде SC+arg, 3 клона в случае плазмиды pWS82-CAR1-3 и 4 клона в случае pWS82-CAR1-4. Полученные трансформанты проверяли с помощью ПЦР на отсутствие аллели CAR1 дикого типа. У всех 7 отобранных клонов полностью отсутствовала аллель CAR1 дикого типа, в то время как клоны, способные расти на среде SC+арг, содержали как нулевую аллель car1Δ, так и аллель CAR1 дикого типа. Корректность замены аллели CAR1 на аллель car1Δ у 4 клонов из 7 отобранных проверяли полногеномным секвенированием. Полученные ауксотрофные car1Δ мутанты восстанавливали прототрофность при трансформации мультикопийной плазмидой, несущей интактный ген CAR1.

Один из отобранных car1Δ клонов, получивший название I-328-4, анализировали с использованием подходов и методик, общепринятых в микробиологии виноделия и энохимии [Методы технохимического контроля в виноделии / под ред. Гержиковой В.Г. / Симферополь: «Таврида». – 2002. – 260 с.; Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия // Симферополь: Таврида. – 2003. – 560 с], а также при помощи газовой и жидкостной хроматографии. В качестве контрольного использовали исходный штамм I-328. Штаммы характеризовали по стандартному набору таксономических признаков [Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей // М.: Издательство Академии наук СССР – 1954 – 427 с.; Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования // М.: Наука. – 1975. – 389 с.], а также по технологическим характеристикам [Риберо-Гайон Ж., Пейно Э., Риберо-Гайон П., Сюдро П. Теория и практика виноделия. Характеристика вин. Созревание винограда. Дрожжи и бактерии // пер. с французского. – М.: «Пищевая промышленность». – 1980. – Т. 2. – с. 111-243.; Бурьян Н.И., Тюрина Л.В. Микробиология виноделия. // М.: Пищевая промышленность. – 1979. – 272 с.; Jiranek V., Langridge P., Henschke P.A. Validation of bismuth-containing indicator media for predicting H₂S-production potential of Saccharomyces cerevisiae wine yeasts under enological conditions // Am. J. Enol. Vitic. – 1995. – V. 46. – № 2. – P. 269-273; Lemaresquier H. Gainvors A. Lequart C. Charlemagne B. Frezier V. Belarbi A. Sélection de levures œnologiques à activité clarifiante: Les différentes techniques utilisées pour caractériser des levures, intérêt de la sélection d’ une levure productrice d’ enzymes pectolytiques // Rev. française d’oenologie. – 1995]. При культивировании штаммов использовали селективные синтетические среды и виноградное сусло из винограда сорта Алиготе одной партии с массовой концентрацией сахаров 235 г/л, титруемых кислот – 7,0 г/л, рН 3,4. Результаты выполненных экспериментов приведены ниже в виде соответствующих примеров.

В результате был получен винный полиплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae I-328-4 ВКПМ Y-5031, обладающий ауксотрофным фенотипом за счет нулевой аллели гена CAR1 в гомозиготе и предназначенный для биосинтеза новых перспективных винодельческих штаммов.

Пример 1. Сравнение штаммов I-328-4 и I-328 по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим признакам.

Морфолого-культуральные признаки. Штаммы культивировали в пробирках с виноградным суслом при температуре (26±0,5)°С. Форму и размер клеток оценивали при микроскопировании культуры в экспоненциальной фазе роста. Размеры клеток оценивали по цифровым изображениям, для обработки и анализа которых использовали компьютерную программу “Image Scope M”. Наличие поверхностного роста и структуру осадка определяли визуально в 30-суточной культуре. Визуально оценивали характер образуемых осадков, наличие кольца и пленки на поверхности среды культивирования (см. Таблицу 3).

Физиолого-биохимические признаки. Способность дрожжей к спорообразованию оценивали по результатам роста на среде Городковой [Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия // Симферополь: Таврида. – 2003. – 560 с]. Посевы инкубировали при температуре (26±0,5)°С, и каждые три дня в течение 5-6 недель микроскопировали культуру на предмет появления спор. Для определения фенотипа исследуемых дрожжей колонии отбирали с агаризованного виноградного сусла и уколом переносили на газон тест-культуры дрожжей с чувствительным фенотипом. Суспензии тех же колоний также помещали на агаризованное виноградное сусло в виде небольшого газона диаметром около 1,5 см, в центр которого уколом вносили биомассу тест-культуры киллерного штамма дрожжей. Посевы инкубировали при температуре (26±0,5)°С в течение 3-х суток. При образовании зоны отсутствия роста вокруг тестируемого штамма на газоне чувствительного штамма его идентифицировали как киллерный (К). Штамм, на газоне которого штамм-киллер образует зоны, идентифицировали как чувствительный. Остальные штаммы относят к нейтральным (см. Таблицу 3). В качестве тест-культур использовали штаммы 47-К (киллерный) и Кахури 7 (чувствительный), депонированные в КМВ «Магарач».

Таблица 3. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства штаммов I-328-4 и I-328.

№ п\п Штамм Морфология клеток Средний размер клеток, мкм Осадок Кольцо Пленка Фенотип Способность к спорообразованию 1. I-328 округло-яйцевидные, встречаются удлиненные и овальные 8,3 × 5,9 Пылевидный нет нет Чувствительный образует аски с 1-4 спорами 2. I-328-4 округло-яйцевидные, встречаются удлиненные и овальные 8,5 × 6,0 Пылевидный нет нет Чувствительный образует аски с 1-4 спорами

Пример 2. Сравнение бродильной способности штаммов I-328-4 и I-328.

Бродильную способность (скорость и полноту сбраживания сахаров) оценивали в лабораторных условиях при культивировании штаммов в виноградном сусле в колбах, закрытых пробками с «бродильными» затворами. В сусло вносили двухсуточный энокулят дрожжей до концентрации 2·10⁶ клеток/мл, и эксперимент по брожению проводили в трех повторностях при температуре (26±1)°С. Ежедневно колбы с бродящим суслом взвешивали, определяя количество выделившегося при брожении диоксида углерода. По окончании брожения (что характеризуется отсутствием изменения массы колб) строили графики выделения диоксида углерода в пересчете на 100 мл культуры и определяли массовую концентрацию сахаров, титруемых и летучих кислот и объемную долю этилового спирта в сброженном сусле (см. Таблицы 4 и 5).

Таблица 4. Бродильная способность штаммов I-328-4 и I-328.

№ п/п Штамм Время, сут Выделение СО₂, г рН Объемная доля этилового спирта, % Массовая концентрация, г/л сахаров титруемых кислот летучих кислот 1 I-328 23 12,5 3,44 14,38 1,52 6,38 0,53 2 I-328-4 23 11,1 3,46 12,85 14,92 6,45 0,69

Таблица 5. Биохимические свойства штаммов I-328-4 и I-328 (Aquilla Biolabs, 48 ч, активная фаза роста).

№ п/п Штамм рН Объемная доля этилового спирта, % Массовая концентрация, г/л титруемых кислот летучих кислот 1 I-328 3,15 7,3 6,08 0,30 2 I-328-4 3,20 5,7 6,53 0,20

Пример 3. Сравнение технологических свойств штаммов I-328-4 и I-328.

Оценку кислото- и спиртовыносливости, холодо- и термостойкости, сульфитостойкости проводили по ростовой реакции клеток дрожжей на низкие значения рН среды, низкие и высокие температуры, высокие значения диоксида серы и высокие концентрации этилового спирта. Клетки культивировали в стандартной полной среде YPD. Для оценки холодостойкости инкубацию проводили при температуре (10±1)°С, термостойкости – при (35±1)°С; для оценки кислотовыносливости – при температуре (26±1)°С, рН среды доводили до 2,8. Для оценки сульфитостойкости инкубацию проводили при температуре (26±1)°С и массовой концентрации общего диоксида серы в среде 100 мг/л. Для оценки спиртовыносливости инкубацию проводили при температуре (26±0,5)°С, в среду вносили этиловый спирт до достижения его объемной доли 10 или 12%. Для более четкого выявления реакции дрожжей на новые условия штаммы засевали в пробирки из расчета 0,8-3·10⁴ клеток/мл. Состояние культур в пробирках анализировали в течение 5 суток ежедневно. Ростовую реакцию на заданные условия культивирования (наличие роста, отсутствие роста) оценивали визуально (см. табл. 6).

Таблица 6. Оценка устойчивости штаммов I-328-4 и I-328 в стрессовых условиях.

Штамм Начало роста, сут. Температура 10°С Температура 37°С рН 2,6 Массовая концентрация общей сернистой кислоты,
100 мг/л Объемная доля этилового спирта, 10% Объемная доля этилового спирта, 12% I-328 5 1 1 1 4 отсутствие роста I-328-4 5 1 1 2 4 отсутствие роста

Пример 4. Сравнение биохимических свойств штаммов I-328-4 и I-328.

В таблицах 7а и 7б приведены результаты хроматографического анализа образцов штаммов I-328-4 и I-328 после 48 ч полного выбраживания.

Таблица 7а. Жидкостная хроматография (г/л)

Компонент Штаммы I-328 I-328-4 лимонная к-та 1,87 / 0,81 2,35 / 0,62 винная к-та 2,24/ 3,21 1,95 / 3,07 яблочная к-та 3,07 / 1,37 3,97 / 1,57 янтарная к-та 1,13 / 0,43 1,27 / 0,42 молочная к-та 1,05 / 1,51 1,05 / 1,88 уксусная к-та 0,25 / 0,31 0,18 / 0,54 биозы 1,7 / 0,5 0,55 / 0,33 глюкоза 24,29 / 2,65 39,88/ 2,97 фруктоза 64,4 / 0,73 79,01 / 14,32 глицерин 5,34 / 6,16 5,42 / 6,88 этанол, % 7,94 / 14,56 6,08 / 13,58

Таблица 7б. Газовая хроматография (мг/л)

Компонент Штамм I-328 I-328-4 ацетальдегид 74,7 / 106,4 27,6 / 57,4 этилацетат 3,5 / 15,1 2,3 / 8,0 спирт метиловый 7,1 / 19,8 4,9 / 9,7 спирт пропиловый 6,7 / 17,3 5,1 / 6,9 спирт изобутиловый 48,0 / 53,0 45,8 / 31,5 спирт изоамиловый 39,9 / 79,5 33,5 / 36,5 этилкапроат 15,3 / 29,4 11,9 / 13,0 этиллактат – / 3,9 – / 2,2 гексиловый спирт – / 0,4 – / 0,4 уксусная кислота 644,4 / 483,0 811,9/702,7 БГ1 рацемат 817,0 / 877,4 497,9/955,9 изомасляная кислота 17,7 / 1,1 35,4 / 2,0 БГ2 мезо 50,2 / 76,6 34,7 / 88,8 пропиленгликоль 106,0 / 161,5 88,5 / 236,3 этилкапринат 9,1 / 7,0 10,3 / 6,8 фенилэтиловый спирт 45,0 / 30,4 61,0 / 25,4 каприловая кислота 0,8 / 1,0 1,9 / 1,0 каприновая кислота 682,1 / 13,1 1048,3/121,6 глицерин 6,325,2 / 5663,0 5284,5/7232,1

Пример 5. Сравнение динамики роста штаммов I-328-4 и I-328.

Результаты сравнения динамики роста штаммов I-328-4 и I-328 приведены в табл. 8.

Таблица 8. Динамика роста штаммов I-328-4 и I-328 (Aquilla Biolabs)

Штамм Лаг-фаза,
ч Экспон. фаза, ч Оптическая плотность (D) в конце эксп.фазы Оптич. плотность (D) — 48 ч Активная фаза роста µ, 1/ч g, ч D Период, ч I-328 4,0 27,0 14,4 24,1 0,27 2,6 4,1 14,5 I-328-4 3,5 30,5 10,4 14,1 0,26 3,1 4,5 18,5

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен винный полиплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae I-328-4 ВКПМ Y-5031, обладающий ауксотрофным фенотипом за счет нулевой аллели гена CAR1 в гомозиготе. Изобретение может быть использовано для получения винодельческих штаммов. 8 табл., 5 пр.

Винный полиплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae I-328-4 ВКПМ Y-5031, обладающий ауксотрофным фенотипом за счет нулевой аллели гена CAR1 в гомозиготе и предназначенный для получения винодельческих штаммов.