Способ определения целостности ядер в срезах биологической ткани на цитологическом препарате Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

( ел

ел

со

00

1451598

Изобретение относится к биологии, в частности к цитологии и касается идентификации целостности ядер в срезах биологической ткани. Преимущественно изобретение предназначается для определения размеров ядер и цитофотометрического исследования ДНК ядер в срезах.

Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Кусочки листьев проростков пшеницы сортов Эммер и Баллади 116 фиксируют по Карнуа, после чего их обезвоживают, заключают

пшеницы. Максимальн Il,50i3,80, минима При используемой то (10 мкм) ядро такой разрезать только на видно, что в этом с меры резаных ядер м меров целых. На поп листьев пшеницы,исп мый способ, при пом ляр-микрометра прои целых и отдельно ре 99%). Средние раз 15 (9,41и10,48) оказал резаного (7, ,2 1

Данные, полученн те, служат основани ния изменения колич

10

35

в парафин и приготавливают срезы тол- 20 ДНК и размеров ядер щиной 10 мкм общепринятым методом. Депарафинированные срезы окрашивают по Фельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-И-1 в проходящем свете от лампы накаливания. Все ядра 25 имеют одинаковый цвет - сиренево- красный. При просмотре этих же ядер в фазовом контрасте одни из них имеют зеленый цвет, другие - желтый и оранжево-желтый. Применение других кис- ЗО лых и нейтральньтх фиксаторов, обычно .применяемых для исследования ДНК ядер посредством реакции Фельгена, на результат не влияет.

Методом послойной реконструкции удалось установить, что зеленый цвет имеют целые ядра, а желтый или оранжевый - резаные. Из 87 ядер идентифи-; цируют 35 как целые и 52 как резаные.

Для доказательства установленного п явления применяют еще два методических подхода.

Из мезофилла листьев проростка пшеницы выделяют протопласты, где все ядра заведомо целые. После окрас-дч ки по Фельгену выделенных протопластов в суспензии и приготовления мазков препараты просматривают под микроскопом. В проходяр;ем свете все ядра в мазках, как и в срезах, имеют сиренево-крясный свет, .а в фазовом контрасте все ядра зеленые. Так как в мазке все ядра заведомо целые, то это подтверждает связь зеленого цвета ядра в фазовом контрасте с его целостностью.

При помоищ винтового окуляр-микрометра в мазках устжсавливают средние размеры ядер клеток мезофилла листьев

50

55

ростков пшеницы, по телем стеблевой ржа

Пример 2. Свеж сы помещают в 10%-ны 4с, измельчают на 6 мм , постфиксирую ледяная уксусная ки шении 3:1 в течение воживают, заключают готавливают срезы т 5 мкм общепринятым м финированные срезы Фельгену и просматри скопом ЛЮМАМ-И-1 в от лампы накаливания ют одинаковый цвет Ный. Цитоплазма окр цвет. При просмотре фазовом контрасте бо них зеленого цвета, желтого. Цитоплазма приобретая бледно-же что не мешает четко как целые, так и рез

Для доказательств леный цвет в фазовом срезах печени так же пшеницы, имеют целые ют ядра по Фельгену в целом кусочке пече этого кусочка готовя парат, где ядра заве ком цитологическом п микроскопом в проход ядра имеют один цвет красньш, а цитоплаз фазовом контрасте яд та, а цитоплазма n вого.

пшеницы. Максимальный диаметр ядра: Il,50i3,80, минимальный 5,40 + 0,01. При используемой толщине среза (10 мкм) ядро такой величины можно разрезать только на две части. Очевидно, что в этом случае средт:е размеры резаных ядер меньше средних размеров целых. На поперечных срезах листьев пшеницы,используя предлагаемый способ, при помощи винтового окуляр-микрометра производят измерение целых и отдельно резаных ядер (Р 99%). Средние размеры целого ядра (9,41и10,48) оказались больше, чем резаного (7, ,2 1) .

Данные, полученные в Эксперименте, служат основанием для исследования изменения количества лабильной

ДНК и размеров ядер

35

20 ДНК и размеров ядер 25 ЗО

;

п

дч

в листьях про50

55

ростков пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины.

Пример 2. Свежую печень белой крысы помещают в 10%-ный формалин при 4с, измельчают на кусочки объемом 6 мм , постфиксируют в смеси этанол- ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1 в течение 2 ч. Затем обезвоживают, заключают в парафин и приготавливают срезы толщиной 10 и 5 мкм общепринятым методом. Депара- финированные срезы окрашивают по Фельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-И-1 в проходящем свете от лампы накаливания. Все ядра имеют одинаковый цвет сиренево-крас- Ный. Цитоплазма окрашена в розовый цвет. При просмотре этих же ядер в фазовом контрасте большинство из них зеленого цвета, меньшая часть желтого. Цитоплазма видоизменяется, приобретая бледно-желтый оттенок, что не мешает четко различать ядра как целые, так и резаные.

Для доказательства того, что зеленый цвет в фазовом контрасте в срезах печени так же, как и в листьях пшеницы, имеют целые ядра, окрашивают ядра по Фельгену непосредственно в целом кусочке печени и затем из этого кусочка готовят давленый препарат, где ядра заведомо целыео В таком цитологическом препарате под микроскопом в проходя1чем свете все ядра имеют один цвет - сиренево- красньш, а цитоплазма - розовый. В фазовом контрасте ядра зеленого цвета, а цитоплазма no-r;piv. розового.

Для доказательства того, что реза- ные ядра в среяах печени в фазовом контрасте имеют желтьй цвет, определяют число резаных ядер в срезах толщиной 10 и 5 мкм. Очевидно, что в более тонком срез должно быть больше резаных ядер, следовательно, в фазовом контрасте большинство ядер имеет желтый цвет. Число зеленых и желтых

ядер определяют при помощи 12-клавиш- ного счетчика по препарату, выбирая несколько случайных полей зрения о В пяти полях зрр.ния срезов толщиной 10 мкм в среднем оказапось 24,5 жел- тых ядер, а в срезах толщиной 5 мкм - 41,8. Таким образом, уменьшение толщины среза в 2 раза примерно во столько же раз увеличило число резаных ядер, следовательно, резаные ядра .

печени в фазовом контрасте имеют желтый цвет. Формула изобретения

Способ определения целостности ядер в срезах биологической ткани на цитологическом препарате, включа- гаций отбор пробы ткани, фиксацию, обезвоживание и заключение ее в парафин, приготовление микротомных срезов, их окрашивание по Фельгену с последуицим определением под световым микроскопом, отли-чающийс я тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения за

счет идентификации целостности ядра непосредственно в одиом срезе, определение ведут в фазовом контрасте и по зеленому цвету ядра судят о его целостности.

Изобретение относится к биологии, в частности к цитологии и касается идентификации целостности ядер в срезе Преимущественно изобретение предназначается для определения размеров ядер и фитофотометри- ческого исследования ДНК ядер в срезах. Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра. Для этого отбирают пробу исследуемой ткани, фиксируют ее, обезвоживают, заключают в парафин, готовят микротомные среяы, окрашивают их по Фельгену, а затем микроскопируют в фазовом контрасте и по зеленому цвету ядра судят о его целостности. а W