Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерий, и способ определения антилизоцимной активности бактерий Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 C12Q1/00 C12N15/00 C12R1/22 

те в жидких питательных средах образует равномерную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Прототроф на минимальной среде с глюкозой растет в пределах 4-45°С. В качестве единственного источника углерода, кроме глюкозы, может использовать цитраты, мукаты, малонаты, фруктозу, галактозу, арабинозу, лак- тозу, сорбит и дульцит. Обладает уреазной и лизин-декарбоксилазной активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов. Обусловливает положительную реакцию «Ьогес-Проскауэра. Желати- ну не разжижает. Гемолизина не образует.

Устойчивость к антибиотикам.

Бактерии устойчивы к канамицину (50 мкг/мл), ампициллину (500 мкг/мл), хлорамфениколу (50 мкг/мл) и сульфаниламидам (50 мкг/мл).

Антилизоцимная активность.

Инактивируют 20 мкг/мл лизоцима, показатель А 0,98.

Стабильность антилизоцимного признака. При выращивании бактерии на МПА, содержащим 50 мкг/мл канамици- на или 5000 мкг/мл ампициллина, или 50 мкг/мл хлорамфеникола, получают микробные клетки, характеризующиеся высокой антилизоцимной активностью. Это связано с тем, что гены, контролирующие антибиотикоустойчивость и синтез антилизоцимного фактора, ло- кализованы на одном репликоне плаз- миды .

Рестрикция плазмиды , кодирующей синтез антилиэоцимного фактора, показала, что данная плазмида имеет один сайт узнавания для рест- риктаз EcoR 1 и Xho 1,16 - для Msp 1; 17 - KpN 1; 18 - Bglll и 20 - для эндонуклеазы Hind III. Для контроля наличия у бактерий референс штамма K.pneumoniae AB-86 плазмиды следует определить сохранение микробными клетками устойчивости к указанным антимикробным веществам, поскольку детерминанты резистентности нахо- дятся на этом же плазмидном репликоне вместе с генами, детерминирующими антилизоцимную активность.

Способ осуществляют следующим образом.

Референс-штамм и испытуемые бактериальные культуры выращивают раздельно в минимальной среде при шуттелиро- вании, отделяют культуральную жип

кость от клеток центрифугированием. Надосадочную жидкость смешивают с суспензией клеток микрококка и раствором лизоцима. Выдерживают при комнатной температуре в течение 25-30 мин и измеряют оптическую плотность при длине волны 400±20 нм.

Активность антилизоцимного фактора прямо пропорциональна оптической плотности. В качестве контролей используют смеси: без лизоцима (К,) - ее оптическую плотность принимают за плотность образца с полным подавлением действия лизоцима; без культураль- ной жидкости (замененной стерильной минимальной средой) - после 30 мин инкубации при комнатной температуре (К) этот контроль соответствует полному отсутствию антилизоцимной активности (полное просветление).

Антилизоцимную активность (А) куль туральной жидкости исследуемого штамма рассчитывают по формуле (с точностью до второго знака)

А

Но -.

к, - v

0

о 5

5

где М0 - оптическая плотность опытной смеси;

К

и К - оптические плотности первого и второго контролей.

Показатели А, равные 0,3 и выше, считаются положительными при учете антилизоцимной активности как эпид- маркера изучаемого штамма. Показатели, равные и выше 0,7, позволяют отнести выделенный штамм к штаммам-бактериям, способным к длительному переживанию в условиях организма хозяина, связанному с процессом реконвалесцентного бактерионосительства.

Пример. Референс штамм Klebsiella pneumoniae AB-86, несущий плазмиду рА , контролирующую синтез антилизоцимного фактора, выращивают в минимальной среде М9, содержащей на 1 л, %: Na2HP04 6,0; КН.РО 3,0; NH4C1 1.0; NaCl 0,5; глюкоза 1, рН 7,2-7,0. Для ауксотрофных штаммов применяют добавки в стандартных концентрациях: аминокислоты 20 мкг/мл и витамины 1 мкг/мл. Можно использовать среду LB, содержащую на 1 л Bac-to-tryptou 10,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, и Naf l 10,0 г. Бактерии,

выращенные при 37 С в течение 18 ч

(при шуттелировании 200 качаний/мин время можно сократить до 10 ч), осаж дают центрифугированием при 4000 об/ми в течение 20 мин. Взвесь клеточных стенок М.lysodeiktieus готовят известным способом. Можно использовать успенэию живых бактериальных клеток микрококка, выращенных в течение 18 ч, на 1,5% мясопептонном агаре с 1%-ной глюкозой, содержащей в 1 мл 1x101 микробных тел. Готовят рабочий раствор лизоцима, содержащего 100 мкг/мл препарата, в физиологическом растворе хлористого натрия.

Объемное соотношение культурапь- ной жидкости, суспензии микрококка и раствора лизоцима составляет 10:5:1. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 25-30 мин и измеряют оптическую плотность при длине волны 400120 нм.

Получают следующие показатели: Мо 0,94; К, 0,95; Кг 0,21.

Производят расчет по формуле

А Ki

К1 Ч

ра в ный 0,98.

Штаммы, выдепенные при вну, рибол ничной инфекции, характеризуются различной степенью антилизоцнмной активности.

Штамм К.pneumoniae АВ-Нб обпадае наиболее выраженной антилизопимной активностью (А 0,98), которая при использовании метода раститровки соответствует инактивации 20 мкг/мл лизоцимл.

Лабораторные штаммы E.coli К( могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Бактерии выращивают как описано в примере, и культуральную жидкость проверяют

1537689

на наличие антилнзоцимной активности в соответствии с указанной выше методикой тестирования (пример).

-,„ - 0,35, Kf - 0,35, Кг

При этом получены следующие показатели: М0 0.35. К 20, А 0.

Все штаммы E.coli К-12 дают отрицательные показатели антилизоцимной активности.

Использование способа и нового референс-штамма позволяет ускорить способ (1 сут вместо 48-72 ч) и повысить точность количественного оп- ределения антилизоцимной активности бактерий.

Формула изобретения

1.Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК № 151, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерии.

2.Способ определения антилизоцимной активности бактерий, включающий посев и выращивание исследуемой культуры в присутствии лизоцима и тест- культуры Micrococcus lysodeiktucus

и учет полученных результатов, о т- л и чающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения точности при количественной оценке антилизоцимной активности, осуществляют раздельное выращивание исследуемой культуры и референе-штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК № 151 в жид- ких питательных средах, отделяют су- пернатант и инкубируют последние с

суспензией тест-культуры и лизоцимом в течение 25-30 мин, а антилизоцим- ную активность определяют по оптической плотности инкубированных суспензий.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для прогнозирования реконвалесцентного бактерионосительства. Цель изобретения - ускорение способа и повышение точности при количественной оценке антилизацимной активности. Штамм KLEBSIELLA PNEUMONIAC выделен из объектов окружающей среды и депонирован под номером ГИСК N 151. Штамм несет плазмиду PAL_T-60, кодирующую синтез антилизоцимного фактора. Штамм инактивирует 20 мкг/мл лизоцима, показатель антилизоцимной активности А = 0,98. Референс-штамм N 151 и исследуемую культуру раздельно выращивают в жидкой питательной среде, затем смешивают с раствором лизоцима и суспензий MICROCOCCUS LUSODEIKTUCUS. Полученные смеси выдерживают в течение 25 - 30 мин. и измеряют оптическую плотность при длине волны 400±200 нм. Активность антилизоцимного фактора прямо пропорциональна оптической плотности. Показатель А исследуемой культуры определяют по формуле, сравнивают с показателями А референс-штамма и определяют концентрацию лизоцима, которую способна инактивировать исследуемая культура. 2 с.п. ф-лы.