ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE ГИСК №278-ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ЛИЗОЦИМА Российский патент 2008 года по МПК C12N9/36 C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения ингибитора лизоцима.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования ингибитора лизоцима.

Указанный технический результат достигнут новым штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278.

Штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2004 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ИКВС УрО РАН г.Оренбурга.

Полученный штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича и имеет регистрационный номер 278.

Штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

Клетки представляют собой грамотрицательные, неподвижные палочки, образующие капсулу, размером (0,3...1,0)×(0,6...6,0) мкм.

Мясопептонный агар (37°, 48 часов). Образуют изолированные влажные, слизистые колонии белого или серо-белого цвета. Культура «тянется» при взятии с поверхности агара микробиологической петлей.

Мясо-пептонный бульон (37°, 48 часов). Без встряхивания вызывает равномерное помутнение и выпадение осадка при культивировании в течение 18-24 часов. При встряхивании на качалке среда приобретает равномерную мутность без осадка.

Физиолого-биохимические признаки:

Факультативный анаэроб.

Температурный диапазон роста 25-42°С. Оптимальная температура роста 28-39°С. Максимальная скорость роста при 37-39°С.

Оптимум рН 7,2-7,6.

Сероводород - отрицательный, маннит - положительный, лизин - положительный, индол - отрицательный, орнитин - отрицательный, уреаза - положительный, аргинин - отрицательный, цитрат Симонса - положительный, малонат натрия - положительный, фенилаланин - отрицательный, β-галактозидаза - положительный, инозит - положительный, адонит - положительный, целлобиоза - положительный, сахароза - положительный, трегалоза - положительный, маннитол - положительный, ацетоин - положительный, эскулин - положительный, сорбит - положительный, рамноза - положительный, раффиноза - положительный, дульцит - положительный, глюкоза - положительный, реакция Фогес-Проскауера - положительная.

Условия хранения при температуре 4°С культура после лиофильной сушки или выращенной в 0,3% МПА (рН 7,2-7,6) и залитая стерильным вазелиновым маслом.

Условия и состав среды для размножения - МПБ при Т 32-33°С (рН 7,2-7,6), 1,5% МПА при Т 37°С в течение 18-24 часов.

Штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 идентифицирован по «Определителю бактерий Берджи» (1997 г.) как штамм вида Klebsiella pneumonia.

Уровень активности продуцируемого Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 ингибитора лизоцима определяется согласно известному способу определения антилизоцимной активности (патент РФ №2126051, опуб. 23.10.1990).

Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК №278.

Пример 1

Бульонную культуру штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 получали выращиванием данного штамма в пробирках в жидкой питательной среде следующего состава: пептон - 10,0 г; NaCl - 5,0 г; вода мясная - 1000,0 мл, рН=7,2-7,4. Температура 37°С, время инкубации 18-24 часа. Полученную бульонную культуру центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут. Культуральную жидкость отделяли от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость. Данная культуральная жидкость представляет собой неочищенный препарат ингибитора лизоцима. Наличие и уровень активности продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 ингибитора лизоцима определяли следующим образом: 0,9 мл полученной культуральной жидкости смешивали с 0,1 мл раствора лизоцима и инкубировали 60-120 минут при 37°С. Затем 0,5 мл смеси культуральной жидкости и лизоцима добавляли к 2,0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus luteus ATCC 15307 и измеряли оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре. В качестве контроля использовали смесь питательного бульона и лизоцима.

О наличии продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 ингибитора лизоцима судили по лизису тест-культуры Micrococcus luteus ATCC 15307. Уровень активности продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 ингибитора лизоцима рассчитывали по формуле: A=V₁*C₁(1-D₀/D_k)/V₂*Y, где А - антилизоцимная активность полученного ингибитора лизоцима (мкг/мл*ОП), V₁ - объем раствора лизоцима исходной концентрации, V₂ - объем супернатанта бульонной культуры. С₁ - исходная концентрация лизоцима, Y - оптическая плотность бульонной культуры, D₀-изменение оптической плотности тест-культуры Micrococcus luteus АТСС 15307 между 30 и 150 сек в опыте, D_k - изменение оптической плотности тест-культуры Micrococcus luteus ATCC 15307 между 30 и 150 сек в контроле.

Уровень активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 составил от А=(1-0,032/0,125)*2,2=1,64 до А=(1-0,0025/0,125)*2,2=2,16.

Пример 2

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению наличия и уровня активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 и дикими штаммами Klebsiellae sp., выделенными из кишечного биотопа.

При исследовании уровня активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 и дикими штаммами Klebsiellae sp., выделенными из кишечного биотопа, авторами экспериментально установлено, что уровень активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 более высок по сравнению с уровнем активности ингибитора лизоцима, продуцируемого дикими штаммами Klebsiellae sp., что свидетельствует о большей продуктивности заявляемого штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 по сравнению с дикими штаммами Klebsiellae sp.

Результаты исследований приведены в таблице.

Таблица
Сравнительная характеристика уровня активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 и дикими штаммами Klebsiellae sp.Исследуемые штаммы КлебсиеллаУровень активности ингибитора лизоцима (мкг/мл*ОП)0,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,2Клебсиелла Д1+--------- Клебсиелла Д2++++++-----Клебсиелла Д3++---------Клебсиелла Д4++++----- -Клебсиелла Д5+----------Клебсиелла Д6+++------- Клебсиелла Д7++++-------Клебсиелла Д8++++++-----Клебсиелла Д9++---------Клебсиелла Д10
Клебсиелла Д11++++-------+----------Клебсиелла ГИСК №278+++++++++++Клебсиелла Д1...Д11 - дикие штаммы Klebsiellae sp.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника. Штамм используется для получения средства для продуцирования ингибитора лизоцима. Уровень активности ингибитора лизоцима, продуцируемого штаммом, составляет 1,64-2,16 мкг/мл*ОП. 1 табл.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК №278 - продуцент ингибитора лизоцима.