Способ определения антилизоцимной активности штаммов менингококка Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/34 C12Q1/08 

Известны различные модификации одного способа определения антилизоцимной активности штаммов менингококка - определение АЛА на плотных питательных средах, содержащих - определенные концентрации кристаллического лизоцима.

Недостатками данного способа являются сложность постановки опыта, недостаточная чувствительность теста и длительность исследования.

Наиболее близким у предлагаемому яв- лятеся метод, основанный на создании градиента концентрации лизоцима на одной чашке с плотной питательной средой. В чашку Петри вносят 20 мл расплавленного агара и ставят в наклонное положение для получения скошенного агара. После засты- зэния среды чашку кладут строго горизонтальное положение и заливают 20 мл 20%-ного сывороточного агара с лизоцимом в максимальной исследуемой концентрации 20-30 мкг/мл. После охлаждения образуется среда, имеющая градиент концентрации лизоцима. На поверхность агара стандартной петлей (d 3 мм) наносится непрерывной полосой по направлению градиента концентрации лизоцима взвесь исследуемой 18-24-часовой культуры менингококка (109 КОЕ/мл).

Через 18-24 ч инкубации в термостате при 37°С культура обрабатывается парами хлороформа и заливается 0.1 мл взвеси индикаторного штамма микрококка (10 К СЕ /мл) в 4 мл 0.7 % -ного питательного агара. Чашки вновь-помещают в термостат при 37°С. Учет результатов проводят по наличию роста M.lysodeikticus вдолк полосы исследуемой культуры. За уровень антилизоцимной активности принимают максимальное значение концентрации фермента, при которой еще отмечается рост M . - .рококка.

Недостатком указанного метода является тс. что он не позволяет изучить энтили- зоиимную активность штаммов в жидких средах, т.е. в условиях, близких к развитию менингококков в биологических жидкостях, в том числе, внутриклеточного паоззитиро- вания. Кроме того, постановка опыта довольно сложная, требует значительного расходования питательной среды и сопряжена с длительностью исследований (не менее 48 ч). Указанная методика определения АЛА может давать существенные отклонения в результатах, связанных с различным числом жизнеспособных клеток во взвеси, взятой для посева менингококка на агаровую среду, и неодинаковой скоростью его размножения, что затрудняет стандартизацию условий постановки данного теста.

Целью изобретения является упрощение способа, повышение чувствительности и ускорение определения.

Цель достигается путем приготовления

взвесей культур изучаемых штаммов менингококка в жидкой среде, содержащей различные концентрации лизоцима, инкубировэния смесей в течение определенного времени при 37°С, определения в

0 .них содержания остаточного лизоцима с использованием высокочувствительной поли- акриламидной среды, с последующим вычислением инактивированных штаммов доз фермента. За уровень антилизоцимной

5 активности принимают максимальную концентрацию лизоцима, полностью анактиви- рованную взвесью менингококка, Применение полиакриламидной среды позволяет выявить концентрации фермента

0 (менее 1 мкг/мл), которые известным способом не могут быть обнаружены, и сократить сроки исследования до 2-4 ч вместо 48 ч.

Параметры постановки теста - концентрации культур менингококка и растворов

5 лизоцима. время инкубации, критерии оценки активности штаммов по антилизоцимно- му признаку, определены следующим образом.

В опыт брали суспензию культуры ме0 нингококка (эталонный штамм № 0646) различной концентрации от 1 до 15 млрд микробных клеток на 1 мл дистиллированной воды. Полученные данные (табл.1) свидетельствуют, что одномиллиардная взвесь

5 не подавляла в течение 1 ч лизоцимную активность в стандартных растворах. Увеличение концентрации менингококка до 2.5 млрд клеток в 1 мл суспензии позволило во всех случаях ингибировать 0.1-0.25 мкг/мл

0 лизоцима. Угнетение фермента в дозе 0.5 мкг/мл наблюдалось лишь в отдельных случаях. Содержание микробных клеток в пределах 5-10 млрд/мл давало постоянные результаты, во всех стандартных растворах

5 с концентрацией лизоцима 0,1-1,0 мкг/мл в течение 1 ч было отмечено ингибирование фермента.

Более высокое содержание микробных клеток (15 млрд/мл) в смеси подавляло активность Фермента в-диапазоне 0,1-2,0

0 мкг/мл, однако повторяемость результатов наблюдалась лишь при исследовании растворов, содержащих 0.1-1.0 мкг/мл фермента. Исследование образцов с концентрацией лизоцима 2.0 мкг/мл позво5 лило выявить ан,тилизоцимную активность менингококка только в отдельных опытах. Отсутствие стабильности результатов при использовании двух с половиной и пятнэд- цатимиллиардной микробной взвеси в растворах 0,5 и 2,0 мкг/мл лиэоцима соответственно явилось основной причиной для ограничения минимальных и максимальных значений концентрации менингококка 5-10 млрд микробных клеток в одном миллилитре смеси.

Чувствительность тесте обусловлена также длительностью инкубации культуры менингококка с лизоцимом. Соответствующие данные представлены в табл.2. Как вид- но из полученных данных табл.2, пятнадцатиминутная экспозиция оказалась недостаточной для проявления антилизо- цимной активности менингококка. Ингиби- рование лизирующего действия фермента в концентрации 0,1-1.0 мкг/мл во всех опытах наступало в теиение 30-60 мин, поэтому увеличение времен экспозиции более 1 ч нецелесообразно. В контрольных образцах, не содержацих культуры менингококка, активность раствора лизоцима в течение 1 ч не изменялась.

Применение стандартных растворов лизоцима позволяет значительно сократить сроки определения антилизоцимной активности штаммов Благодаря учету результатов по времени появления начальной зоны ли- эисо тест-культуры о гельбактериэльной среде Без использования калибровочной кривой. Как показало экспериментальное изучение много-испенных контрольных образцов растворгэ лизсцима с концентрацией 0,25-- 1.0 мкг/мл на полизкриламидной гельбактериэль-о, среде, применяемой в данном способе, временные параметры их, лизирующею эффекта всегда находились в пределах от 30 мин до 2 Параметры уроьи-;й г, тилизоцимной активности по предлагаемому способу определены на 25 ит зммах менингококка. Все взятые в опыт к/г,ьтуры предварительно изучались с псмсгщыс известного теста и были сгруппированы по способности инак- тивировать различные концентрации фермента следующим образом. 7 штаммов с низкой АЛ А (и на т и веровал и 1-5 мкг/мл лизоцима), 8 штэммсв со средней АЛА {6-10 мкг/мл) и 10 штаммов с высокой АЛА(инак- тивировали 10 мкг/мл и более).

Результаты изучения антилизоцимной активности этих штаммов по предлагаемо-. му способу представлены в табл.З.

Как следует из табл.З, концентрация инактивированного лизоцима прямо коррелировала с уровне АЛА штаммов менингококка, определенной известным способом. Полученные сравнительные данные свидетельствуют также о том,что характеристику штаммов можно проводить с помощью трех контрольных растворов лизоцима с концентрацией 0,25; 0,5 и 1 мкг/мл и сценипэть полученные результаты следующим обрэ- зом: при инактивации 0.25 мкг/мл лизоцимз штаммы менингококка считать низкозкгив- ными; при 0,5 мкг/мл - среднеактивными и

при 1 мкг/мл - высокоактивными антилизо- цимному признаку.

Продолжительность исследований на полиакриламидной гельбактериэльном среде в опытных образцах представлена в

0 тэбл.4.

Обнаружение в течение 2 ч лизирующего эффекта смесей культуры менингококка и лизоцима при концентрациях последнего 0,5 и 1,0 мкг/мл указывает на низкую спо5 собность штаммов ингибировать фермент. Наличие зон лизиса в указанный промежуток времени при исследовании образцов, содержащих только 1 мкг/мл лизоцима. характеризует среднюю активность штамма, а

0 отрицательные результаты при исследовании всех растворов - сысокую антилизоцим- ную активность культур менингококка.

Таким образом, для определения АЛА штаммов менингококка целесообразно ис5 пользовать водную суспензию исследуемого штамма, содержащую 5,0-10,0 млрд микробных клеток нз 1 M;I рэствсра лизсцима (концентрации 0,25. 0.5 и .0 мкг/мл), инкубироэать смесь в течение 30-60 мин

0 при 37°С, после чого с пределять количество ингибирпвзниого фегмечта с помощью по- лиакрплгми,1 ой ге. ь озктс-ризльисй среды в течение не более Г ч.

Способ осуществляемся :..гедуО1:;им сб5 разсм.

Суточную культуру меничгск.0- 3 смы- сзютдистиллированной физиологическим растворе с рН 6,2 и готовят густую взвесь, соответствующую густоте

3 50-100 млрд/мл по оптическому ст.дарту плотности ГИСК им.Тарасевича. ГСТОБЯТ растворы с различной концентрацией /изо- цима (0,25; 0,5 и 1,0 мчг/мл) и рззлисэют в пробирки по 1 мл (по 2 пробирки на каждую

5 концентрацию лизоцима). В каждую опытную пробирку вносит микробную взвесь из расчета 5.0-10.0 млрд/мл и инкусируют при температуре 37°С в течение 30- мин. Контролем являются стандартные

0 раствори лизоцима без бактериальной культуры. Затем содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) вносят в за- ранееприготовленные лунки гельбзктериальной среды и инкубируют в

5 течение 2 ч при 37°С. Результаты учитывают визуально по появлению зон лизиса или по их отсутствию вокруг лунок с исследуемой микробной суспензией. Определяют какие максимальные дозы фермента ингибированы. Штаммы менингококка считают низкоактивными по антилизоцимному признаку, если они подавляют действие лизоцима только при концентрации последнего 0,25 мкг/мл; среднеактивными - 0.25 и 0,5 мкг/мл- высокоактивными - 0.25; 0,5 и 1,0 мкг/мл.

П р и м е р 1. Выросшую в чашке Петри суточную культуру менингококка смывают двумя миллилитрами дистиллированной воды. С помощью оптического стандарта мутности определяют густоту взвеси и доводят ее до мутности, соответствующей 50 млрд микробных клеток в 1 мл.

Готовят стандартные растворы кристаллического лизоцима для чего растворяют 10 мг лизоцима в 50 мл дистиллированной воды (конечная концентрации 200 мкг/мл), затем 2 мп данного растпсра соединяют с 48 мл дистиллированной воды (концентрация 8 м .г/мл). Эти pac. можно , ранит ь при температуре 4- Г;°С Е течение 30 и 6 дней ссотг.ет те-знно.

Из последнего рззседения гогсвчт ех .еглрогае рабочий рзствор. г.сдерж.ащий 1 мкг/мл лизоцима. Для этого к 0.5 мл раствора, содержащего 8 МХ-/УЛ фермента, добавляют 3,5 МЛ Д1Н1ТИЛГ .фСВйННСЙ БОДь1.

Дг:я получен; ч ; агтворп с белее низкой концентрацией лизоцима смешивают 0,5 мл рабочего раствора лизоцимэ с 1.5 мт дистиллированной ecr.bi (кснц- ктс.чция 0.25 м-г. мл). 1 мл p.c-o-iero рэстегрэ - с 1 мл воды концентра:. я 0.5 мкг/мл)

Кзхдый и пон отсЕленчых р створов лизоцима. содержащих 0,25; 0,5 и 1 мкг/мл фермента, вносят по 0.9 мл в дое прсб. -рки. В пеовый ряд добавляют по 0,1 мл 50 млрд микробной взвеси изучаемого штамма менингококка, второй бг рут в качестве кснтрс- ля Все пробирки, инкубируют в течение 30 мин при 37°С, затем исслед1- ют нз лизоцим- ную активность с ислопг-зоь змием гельбак- теризльной среды. Гельбактернальная среда готовилась из реакционной смеси, содержащей 5 г акрилзмида; 0,2 N.N -ме- тилен-бис-акриламидз; 0.3 мл N.N.N .N -тет- раметилэтилендиамина; 0.12 г калия персульфата и 0,1-15 г тест-культуры M.lysodelkticus в 90 мл буферного раствора с рН 6,2.

Стекла с внесенными в лунки образцами растворов и смесей инкубируют при в течение 2 ч. Учет результатов, проявившихся на гельбактериэльнсй среде, показал, что опытные образцы, содержащие лизоцим в концентрации 0,25; 0.5 и 1 мкг/мл, не вызывали лизиса микрококка. тогда как соответствующие контрольные растворы его лизировзли в течение 2 ч инкубации, таким образом, изучаемая культура менингококка способна ингибировать лизоцим в максимальной дозе 1.0 мкг/мл, т.е. является высокоактивной по антилизоцимному признаку. При определении известным способом штамм инактивировал 15 мкг/мл лизоцима.

П р и м е р 2. Изучали уровень антилизо- цимной активности свежевыделенного из

0 спинномозговой жидкости больного гнойным менингитом штамма манингококка. Готовили 100 млрд взвеси суточной культуры и растворы лизоцима той же концентрации 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Все последующие

5 операции проводили способом, описанным в примере 1. Время инкубации взвесей 60 мин.

Опытные образцы взвеси менингококка, содержащие лизоцим в концентрации

0 0.25 и 0,5 мкг/мл, лизиса тест-культуры не вызывали, а с 1.0 мкг/мл дали хорошую видимую зону лизиса уже через 40 мин инкубации в термостате. Изучаемый штамм менингококка является среднеактивным по

5 антилизоцимному признаку, так как максимально он способен инактивировать 0,5 мкг/мл лизоцима. При определении АЛА известным способом данный штамм инакти- вировал 6 мкг/мл лизоцима. При изучении

0 предлагаемым способом 28 носоглоточных штаммов микроорганизмов, выделенных от 19 общавшихся с больным лиц в очаге менингококковой инфекции, было установлено, что 5 культур оказались высокозк5 тивными (инактивировали 1 мкг/мл лизоцима}, 14 - среднеактивными (инактивировали 0,5 мкг/мл фермента), а 9 всвсе не обладали антипиэоцимнои активностью. Результаты при этом были получены в

0 течение 4 ч от начала исследования со значительно меньшей затратой рабочего времени и питательных сред.

Сравнительные данные применения предлагаемого и известного способов сви5 детельстэуют о том, что определение АЛА штаммов менингококка с жидкой среде имеет ряд существенных преимуществ (табл.5). По предлагаемому способу используется небольшое количество сред, себестои0 мость которых значительно ниже применяемых в известном тесте. В качестве объекта исследования вместо растущей культуры применяют микробную взвесь, что позволяет стандартизовать методику опре5 деления антилизоцимной активности штаммов.

Изучение знтилизоцимной активности штаммов менингококка в жидкой среде с использованием раствора лизоцима и чувствительной гельбактериаг.ьной среды позаолчет определить способность штаммов ин- гибировать фермент в условиях, близких к таковым при внутриклеточном пэразитиро- вании микроорганизмов,сократить а 12-15 раз время исследования и значительно упростить способ определения АЛА.

Формула изобретения Способ определения антилизоцимной активности штаммов менингококка, предусматривающий приготовление взвеси менингококка в жидкой среде, внесение ее в градиент концентрации лизоцима, инкуои- рование с последующей оценкой антилизо0

цимной активности по характеру роста тест- культуры Micrococcus Lysodekticus. отличающийся тем, что. с целью упрощения способа, повышения чувствительности и ускорения определения, концентрацию взвеси менингококка устанавливают равной 5.0-10,0 млрд микробных клеток на 1 мл раствора лизоцима. градиент концентраций фермента готовят из расчета 0,25; 0.5 и 1.0 мкг/мл раздельно, полученную взвесь инкубируют в течение 30-60 мин. а затем вносят ее в лунки гельбэктериальной толиакрила- мидной среды, включающей тест-культуру.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Цель изобретения - упрощение способа, поИзобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии. Лизоцим обладает способностью подавлять рост многих бактерий. Поэтому штаммы микроорганизмов, которые ингиби- руют данный фермент, получают существенное преимущество в межвидовой конкуренции. Они лучше выживают и при внутриклеточной локализации. Переваривание антилизоцимных штаммов в фагоцитах протекает во много раз медленнее, чем клеток, не обладающих активностью в отношевышение чувствительности и ускорение определения активности. Способ заключается в приготовлении взвесей изучаемых штаммов мэнингскокков с концентрацией 5.0- 10,0 млрд, микробных клеток на 1 мл раствора лизоцима. внесении их в грздпент концентрации лизоцима, инкубировании 30-60 мин смеси с последующим определением остаточного лизоцима и засевом в лунки гельбзктериальной полиакриламидней среды, включающей т е с т - -- у л ь т у р у Micrococcus Lysodekticus. Причем градиент концентрации фермента готсеят из расчета 0.25. 05 и 1.0 . Способ позволяет с ei- сокой слеленью -сч.гс определить способность штаммов инг/Ьиро- t я т ь фермент в условиях, близка к внутриклеточному паразитироззкньг1 микроорганизмов, в 12-15 раз сократить сроки исследования и значи ельно упростить и удешевить метод определения зчти- лизоцимчой активности с..ежевыделемных штаммов менингококка. 5 табл. (Л С нии Фермента. Кроме того, микроорганизмы с указанными свойствами способны к внутриклеточному размножению. Менингококки относится к внутриклеточным паразитам и обладают антнлизо- цимнсй активностью (АЛА). Широкий диапазон значений АЛА характерен для различных штаммов и даже клонов популяции. Наличие этого фактора расценивается как один из возможных показателей патогенно- сти микроорганизмов, который может быть использован при эпидемиологической характеристике штаммов. vj О vj О ГО

Таблица 1

20

Таблица 2

Примечание. - - отсутствие лизирующего эффекта. + - наблюдается лизирующий эффект.

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5