Изобретение относится к области генетической инженерии, касается способа микробиологического получения фермента и может быть использовано в процессах утилизации целлюлозосодержащих отходов.
Целью изобретения является получение рекомбинантной плазмиды pCU 201, содержащей ген термостабильной β -глюкозидазы, создание штамма Escherichia coli, несущего плазмиду pCU 201 и продуцирующего термостабильную при 60оС β -глюкозидазу.
Описание рекомбинантной плазмиды:
- название - pCU 201;
- размер - 8,5 тыс. пар нуклеотидов (тпн);
- состоит из векторной молекулы ДНК плазмиды pBR 322 и фрагмента ДНК C. thermocellum;
- физическая карта плазмиды, известные регуляторные области и существенные для идентификации плазмиды генетические маркеры представлены на чертеже;
- уникальными сайтами рестрикции на плазмиде обладают рестриктазы Bam HI, Sal GI (чертеж);
- плазмида определяет устойчивость к ампициллину клеток E. coli и синтез в них β-глюкозидазы;
- плазмида неконъюгативна. Описание штамма E. coli С 600 pCU 201.
Штамм E. coli К12 С600, содержащий рекомбинантную плазмиду pCU 201, по особенностям культивирования и морфологии не отличается от любых штаммов E. coli К12, несущих рекомбинатные плазмиды на основе pBR 322. Частота потери клетками рекомбинантной плазмиды составляет менее 0,05% на генерацию.
Сущность изобретения заключается в том, что введение в клетки E. coli в составе плазмиды pCU 201 гена, кондирующего у C. thermocellum термостабильную β -глюкозидазу, обеспечивает в E. coli уровень синтеза термостабильной β -глюкозидазы, способной работать при 60оС, достигающий 0,5 ед/мл культуральной жидкости при гидролизе целлобиозы (в то время как у C. thermocellum это значение не превышает 0,011 ед/мл - 7).
П р и м е р 1. Конструирование банка геномной ДНК C. thermocellum в клетках E. coli С600.
Тотальную ДНК C. thermocellum выделяли из 1 г замороженных клеток, которые ресуспендировали в 16,5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ ЭДТА, 0,1% SDS), содержащего 2 мг/мл проназы, инкубировали 70 мин при 60оС, затем дважды экстрагировали фенолом и переосаждали двумя объемами спирта. 10 мкг выделенной ДНК обрабатывали 2 ед рестриктазы Sau ЗА в общем объеме реакционной смеси 100 мкл, содержащей 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl2 и мМ ДТТ, при 37оС. Через временные интервалы 30 с, 5 мин и 30 мин отбирали пробы и анализировали в электрофорезе. Одновременно 2 мкг плазмиды pBR 322 обрабатывали 5 ед рестриктазы Bam HI 60 мин при 37оС в 20 мкг того же буфера. Реакцию останавливали прогревом пробы 10 мин при 65оС. От рестриктазы освобождались экстракцией равным объемом фенола и затем хлороформа с последующим осаждением ДНК спиртом. Осадок растворяли в 20 мкл воды.
Для легирования смешивали 20 мкл ДНК C. thermocellum, обработанной Sau ЗА в течение 5 мин с 20 мкл линеаризованной по Bam HI ДНК pBR 322 и с 30 мкл буфера, содержащего 150 мМ трис-HCl, pH 7,9, 20 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ 0,2 мМ АТФ и 0,5 мг/мл БСА, добавляли 10 ед ДНК-лигазы фага Т4 и инкубировали 16 ч при 10оС.
Для трансформации одну колонию клеток штамма E. coli К12 С600 засевали в 5 мл L-бульона (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl) и выращивали с аэрацией в течение ночи при 37оС. Полученную ночную культуру разводили в 200 раз теплым L-бульоном и подращивали 2 ч в тех же условиях. После этого клетки охлаждали до 0оС, осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в роторе JA-20 центрифуги J2-21 Becman. Осадок ресуспендировали в равном объеме ледяного стерильного раствора CaCl2 и инкубировали 30 мин при 0оС. Затем клетки снова осаждали и ресуспендировали в 1/20 начального объема того же буфера.
К 1,5 мл полученных таким образом компетентных клеток добавляли 150 мкл легированной ДНК, инкубировали 30 мин при 0оС, затем 2 мин при 42оС, добавляли 15 мл L-бульона и инкубировали с аэрацией 1 ч при 37оС. Различные объемы полученной смеси высевали на чашки с агаризованной L-средой, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, которые инкубировали 16 ч при 37оС до появления колоний трансформантов.
П р и м е р 2. Отбор клонов, обладающих β-глюкозидазной активностью.
Полученную в предыдущем примере трансформационную смеси высевали на чашки таким образом, чтобы получить на чашке 500-700 трансформантов. С помощью бархата колонии реплицировали на чашке с такой же средой, реплики заливали 0,5% агаром, содержащим PC буфер (12 мМ цитрата аммония, 50 мМ K2HPO4, pH 6,3), 0,1% эскулина и 0,05% цитрата аммонийного железа, и инкубировали 3 ч при 60оС. β-Глюкозид эскулин под действием глюкозидазы превращается в эскулетин, который в присутствии солей железа дает черный комплекс, поэтому вокруг колоний, экспрессирующих β- глюкозидазу, образуется черный ореол (10). При анализе 5˙103 рекомбинантных колоний были отобраны два клона, давшие положительный ответ в тесте и содержащие рекомбинантные плазмиды размером 7,9 тпн и 8,5 тпн. Рестрикционный анализ показал, что плазмиды несут перекрывающиеся последовательности ДНК C. thermocellum. Большая плазмида, обозначенная pCU 201 была выбрана для дальнейшего анализа. Результаты рестрикционного анализа pCU 201 представлены на чертеже.
П р и м е р 3. Определение β- глюкозидазной активности в лизатах клеток E. coli С600/pCU 201 при 60оС.
А. Получение лизата клеток E. coli С600/pCU 201.
50 мл Ночной культуры клеток E. coli С600/pCU 201 в L-среде осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5 тыс. об. в 1 мин, клетки промывали 50 мМ РС-буфера (pH 6,3), ресуспендировали в 5 мл PC-буфера/ лизировали ультразвуком и удаляли в клеточный дебрис центрифугированием при 10 тыс. об. в 1 мин в течение 15 мин. Далее в полученных лизатах определяли активность β-глюкозидазы двумя стандартными методами - по способности гидролизировать целлобиозу и паранитрофенол - β -D-глюкопиранозид (ПНФГ).
Б. Целлобиазная активность.
Единица активности β -глюкозидазы определяется как число мкМ глюкозы, образующееся под действием фермента на целлобиозу за 1 мин. Количество глюкозы в растворе определяли глюкозо-оксидным методом. Для проведения реакции к 1 мл 1% -ного раствора целлобиозы добавляли 3 мл РС-буфера и 1 мл лизата клеток, инкубировали смесь при 60оС. Через различные промежутки времени отбирали пробы объемом 0,25 мл, добавляли 2,15 мл глюкозооксидазного пероксидазного реагента, который готовится следующим образом: растворяют глюкозооксидазу в 0,1 М фосфатном рН 7,0 в концентрации 15 мг/мл; растворяют пероксидазу в том же буфере, чтобы оптическая плотность раствора при 403 нм составляла 0,25 единиц; для получения реагента к 100 мл того же буфера добавляют 0,02 мл раствора переоксидазы и 0,1 мл раствора глюкозооксидазы. Смесь инкубировали в течение 5 мин, добавляли 0,1 мл 0,6% раствора о-дианизидина в абсолютном этаноле и регистрировали начальную скорость образования окрашенных продуктов при 460 нм. Тангенс угла наклона графика зависимости оптической плотности от времени прямо пропорционален концентрации глюкозы в образце. Активность β -глюкозидазы определяли в линейной области по калибровочной кривой растворов глюкозы.
В. Арил- β -глюкозидазная активность.
Единица арил- β -глюкозидазной активности определяется как число мкМ паранитрофенола, образующегося под действием фермента на ПНФГ за 1 мин. Для определения активности к 5 мл 4 мМ раствора ПНФГ добавляли 7,5 мл РС-буфера, 5 мл лизата клеток, инкубировали смесь при 60оС. Через различные промежутки времени отбирали пробы по 1 мл, добавляли 2 мл 1М Na2CO3 и измеряли оптическую плотность при 400 нм. Оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации паранитрофенола. Активность β -глюкозидазы определяли в линейной области по калибровочной кривой растворов паранитрофенола.
Г. Определение концентрации белка в лизате.
Для определения белка в лизате использовали раствор Кумасси Бриллиантовый Блюс - 250 (100 мг кумасси, 100 мл этилового спирта, 100 мл 85% -ной ортофосфорной кислоты, 800 мл воды). К 1,5 мл раствора добавляли 0,3 мл анализируемого лизата и измеряли оптическую плотность при 590 нм, прямо пропорциональную концентрации белка, которую сравнивали с калибровочной кривой растворов альбумина. (56) Pentilla M. , Nevalainen K. , Raynal A. , Knowles J. - Mol. Gen, 1984, v. 194, p. 494.
Raynal A. , Gnerinean M. - Molec. Gen. , 1984, v. 195, p. 108.
1. Рекомбинантная плазмида pCU 201, содержащая ген термостабильной b-глюкозидазы, состоящая из плазмиды pBR 322, в Bam H1 сайт которой клонирован фрагмент ДНК размером 4,1 тпн, полученный при частичном гидролизе рестриктазой Sau 3А ДНК Clostridium thermocellum и содержащий в своем составе ген термостильной при 60 С b-глюкозидазы. 2. Штамм Escherichia coli K12 С600, содержащий плазмиду pCU 201, коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика, продуцирующий термостабильную b-глюкозидазу.
