РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PCCS, КОДИРУЮЩАЯ СОМАТОСТАТИН-14, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОСТАТИНА-14 Российский патент 1994 года по МПК C12N15/12 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК для получения соматостатина-14 и штамм бактерии Escherichia coli - продуцент соматостатина-14.

Описано конструирование экспрессирующих плазмидных векторов, предназначенных для продукции под контролем промоторов гибридов соматостатина-14 с различными белками носителями [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7] .

Недостатком этих векторов является, в одних случаях, нестабильность плазмиды и низкий уровень экспрессии гибридного белка в клетках E. coli, в других - трудоемкость конструирования и способов достижения экспрессии гибридных генов.

Известны штаммы-продуценты соматостатина-14 [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7] , но как штамм-прототип E. coli RRI [1] , так и другие штаммы-аналоги имеют высокий уровень протеолитической активности.

Однако данный штамм содержит мутации, снижающие деградацию аномальных белков, мутантных белков, и стабильно сохраняет амбер фрагменты.

Целью изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей в своем составе ген соматостатина-14, и штамма-продуцента соматостатина-14 с использованием штамма Escherichia coli со сниженным уровнем деградации аномальных белков.

Сконструированная рекомбинантная плазмида pCCS размером 4920 п. н. содержит фрагмент вектора pBR 325 размером 4860 п. н. с геном -Лактамазы и частью модифицированного гена хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ), к 3'-концу которого через синтетический линкер, содержащий сайт рестрикции EcoRI и фланкированный с 5'-конца нуклеотидной последовательностью GG, подстроен по EcoRI сайту синтетический ген соматостатина-14. Данная плазмида детерминирует конститутивный синтез гибридного белка САТ-соматостатин-14 под контролем собственного промотора САТ в клетках E. coli МКД 3207 со сниженным уровнем деградации аномальных белков.

П р и м е р 1. Сборка и молекулярное клонирование гена соматостатина.

Олигонуклеотиды 1-10 синтезируют блочным триэфирным методом в растворе (см. чертеж).

Каждую из цепей химически синтезированных олигонуклеотидов (1-10) фосфорилируют отдельно. Реакцию проводят в 10 мл буфера трис-НСl рН 9,5, содержащего 10 мМ MgCl₂, 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ, 100 пмоль олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т₄ в течение 1 ч при 37^оС. После окончания реакции энзим инактивируют прогреванием 65^оС 10 мин.

Для клонирования гена соматостатина-14 применяют плазмидный вектор pBR 325, который в качестве маркерных генов содержит гены устойчивости к ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу. Молекулярное клонирование гена, кодирующего соматостатин-14, проводят следующим образом: 5 мг плазмиды pBR 325 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и BamHI (по 5 ед. ) в буфере трис-HCl рН 7,5, содержащем 100 мМ NaCl, 7 мМ MgCl₂, 7 мМ 2-меркаптоэтанол при 37^оС в течение 2 ч. После инкубации пробы прогревают при 65^оС в течение 10 мин и фрагменты разделяют с помощью электрофореза в 0,8% -ном агарозном геле. Большой фрагмент (4042 п. н. ) экстрагируют из геля пятью объемами 1,5 М NaCl. Супернатант, полученный после центрифугирования суспензии, обрабатывают фенолом и хлороформом, ДНК осаждают этиловым спиртом, предварительно добавив т-РНК до концентрации 10 мкг/мл и растворяют в ТЕ буфере (10 мМ трис-НСl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА).

По 50 ммоль каждого фосфорилированного олигонуклеотида прибавляют к 1 мкг ДНК большого фрагмента pBR 325. Лигирование смеси олигонуклеотидов и фрагмента ДНК проводят в среде, содержащей 66 мМ трис-HCl, рН 7, 6, 5 мМ дитиотрейтол, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ АТФ и 1 ед. ДНК-лигазы фага Т₄. Инкубацию проводят при 12^оС в течение 16 ч.

Полученную лигированную смесь фрагмента ДНК и олигонуклеотидов вводят трансформацией в клетки E. coli НВ101. Трансформацию проводят с использованием замороженных клеток E. coli НВ101. 5 свежих колоний по 2 мм диспергируют на встряхивателе в 1 мл среды SOB (2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт. 10 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄). 500 мкл суспензии клеток вносят в 10 мл жидкой питательной среды SOB и выращивают при 37^оС до титра 7х10⁷ клеток/мл. Клетки охлаждают во льду и центрифугируют 750 g в течение 15 мин при 4^оС, тщательно удаляют супернатант, а осадок суспендируют в 3,3 мл буфера с хлористым рубидием (100 мМ RbCl, 50 мМ MgCl₂ х 4Н₂О, 30 мМ ацетат калия, 10 мМ CaCl₂ х 2Н₂О, 10 мМ глицерин). Клетки выдерживают во льду 2 ч, центригуфируют 750 g и тщательно удаляют супернатант, ресуспендируют в 800 мкл буфера, содержащего 10 мМ МОПС, 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl₂ х 2Н₂О, 15% глицерин и инкубируют 15 мин во льду, после чего аликвоты конечной суспензии замораживают в жидком азоте и используют для трансформации.

200 мкл приготовленной суспензии клеток смешивают с 5-10 мкл раствора лигированной смеси фрагмента ДНК и олигонуклеотидов и инкубируют во льду, затем 30 с при 42^оС и опять во льду 2 мин, добавляют 800 мкл среды SOC (SOB с добавкой 20 мМ глюкозы) и инкубируют с умеренным встряхиванием при 37^оС в течение 60 мин.

Небольшую часть суспензии клеток рассеивают на чашки с агаром, приготовленном на среде SOB, содержащем 0,8% бакто-агар и 50 мкг/мл ампициллина.

Произвольно выбирают 12 клонов, выросших на чашках с ампициллином, выделяют плазмидную ДНК щелочным методом. После обработки этих плазмид различными рестриктирующими эндонуклеазами и электрофореза в агарозном геле выбирают плазмиду искомой конструкции и содержащую в своем составе фрагмент вектора pBR 325, несущий ген bla, определяющий устойчивость к ампициллину, и ген соматостатина-14 и обозначают ее как pSOM 3-13. Анализ нуклеотидной последовательности вставки EcoRI - BamHI из этой плазмиды проводят методом Максама-Гилберта и подтверждают наличие в ней последовательности, кодирующей соматостатин-14.

П р и м е р 2. Конструирование плазмиды для экспрессии соматостатина в клетках E. coli.

Для экспрессии соматостатина в составе химерного белка в клетках E. coli конструируют рекомбинатную плазмиду в несколько этапов. На первом этапе конструируют промежуточные плазмиды pCMRI^- и pSOM 3-13-5.

А. Конструирование плазмиды pCMRI^-.

В векторе pcMRI- гены, кодирующие устойчивость к ампициллину и хлорамфениколу, берут из плазмиды pBR 325, а тандем терминаторов транскрипции фага fd из плазмиды pLK 53.

По 5 мкг плазмиды pBR 325 и pBK 53 обрабатывают совместно эндонуклеазами рестрикции PstI и HindIII (по 10 единиц) в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ транс НСl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол при 37^оС в течение 2 ч, затем в течение 5 мин прогревают при 65^оС. Фрагменты разделяют в 0,8% агарозном геле электрофорезом. Выделение малого фрагмента (1900 п. н. ) pBR 325 и большого фрагмента (2240 п. н. ) pLK 53 проводят как в примере 1.

Для соединения полученных указанным способом фрагментов смешивают по 0,5 мкг ДНК и проводят лигирование в буфере, содержащем 66 мМ трис-HCl рН 7,5, 5 Мм MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ и 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в течение 16 ч при 12^оС. Полученную смесь соединенных фрагментов вводят трансформацией в клетки E. coli НВ 101 кальциевым методом.

50 мкл суспензии клеток E. coli НВ 101 вносят в 10 мл жидкой питательной среды LB и выращивают клетки при 37^оС до титра 7х10⁷клеток/мл. Клетки охлаждают во льду 10 мин и центрифугируют при 750g 15 мин при 4^оС. Осадок клеток суспендируют в 5 мл холодного 0,1 М CaCl₂ и инкубируют во льду 30 мин, затем клетки повторно центрифугируют и осадок суспендируют в 0,8 мл холодного 0,1 М CaCl₂. Клетки выдерживают во льду 12 ч, после чего используют для трансформации.

К 200 мкл клеток добавляют 10 мкл соединенных фрагментов ДНК и инкубируют во льду 40 мин, затем выдерживают 90 с при 42^оС и быстро охлаждают во льду, добавляют 1 мл среды SOC и инкубируют при 37^оС в течение 60 мин.

Клетки высевают на чашки с ампициллином (50 мкг/мл) и хлорамфениколом (30 мкг/мл), а затем проверяют на устойчивость к тетрациклину (20 мкг/мл). Из клонов, имеющих фенотип Ap^rCm^rTc^s выделяют плазмидную ДНК и анализируют по электрофоретической подвижности и рестрикционному анализу. Идентифицируют плазмиду с искомым вариантом и обозначают рСМ.

Из плазмиды рСМ удаляют место расщепления рестриктазой EcoRI, расположенное внутри последовательности, кодирующей САТ, с целью получения плазмиды, удобной для встраивания соматостатина-14, фланкированного EcoRI - BamHI сайтами, в С-концевую область САТ.

Для удаления EcoRI сайта используют химически синтезированный линкер, имеющий последовательность: 5'-AATTGGTGG-3' - одна цепь (I) и 3'-CCACCTTAA-5' - вторая цепь (II).

3 мкг ДНК плазмиды рСМ гидролизуют рестриктазой EcoRI в 30 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl при 37^оС в течение 2 ч. Реакционную смесь прогревают 5 мин при 65^оС, экстрагируют фенолом и осаждают ДНК этанолом. Полученный препарат линейной формы вектора рСМ растворяют в 30 мкл буфера ТЕ.

К 3 мкл раствора ДНК вектора рСМ добавляют по 50 ммоль фосфорилированных холодным АТФ олигонуклеотидов (I и II), 1 ед. ДНК-лигазы фага Т₄ в 30 мкл 66 мМ трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ. Реакционную смесь инкубируют при 12^оС в течение 16 ч.

Полученную лигазную смесь вводят в клетки E. coli НВ101 кальциевым методом трансформации как в примере 2А. Суспензию клеток после трансформации высевают на чашки с агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (30 мкг/мл). Из клонов, имеющих фенотип Ap^rCm^r, выделяют плазмидную ДНК щелочным методом, анализируют по электрофоретической подвижности и рестрикционным анализом. Выбирают плазмиду, утратившую место расщепления рестриктазой EcoRI и обозначают ее как pCMRI^-.

В. Конструирование промежуточной плазмиды pSOM 3-13-5.

Для конструирования плазмиды pSOM 3-13-5 используют плазмиды pSOM 3-13 и pRK. Плазмида pRK аналогична плазмидам серии pUC, но имеет следующую нуклеотидную последовательность полилинкера (9): 5'-AATTCCCGGGAAACTTCGAACGGATCCTGCAGTCGACGGTACCCA-3'.

По 5 мкг плазмиды pRK и плазмиды pSOM 3-13 гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции ScaI (10 ед. ) и EcoRI (10 ед. ) в 50 мкл буфера трис-HCl рН 7,5, содержащего 125 мМ NaCl, 7 мМ MgCl₂, 7 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,01% ВSA при 37^оС в течение 2 ч. Затем прогревают при 65^оС в течение 5 мин.

Большой фрагмент (3529 п. н. ) плазмиды pSOM 3-13 и малый фрагмент (957 п. н. ) плазмиды pRK выделяют из 0,8% агарозного геля как в примере 1. ДНК осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл буфере ТЕ.

По 5 мкл растворов полученных фрагментов смешивают и лигирование проводят в буфере, содержащем 66 мМ трис-HCl, рН 7,6, 5 мМ дитиотрейтол, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ АТФ и 1 ед. ДНК-лигазы фага Т₄. Инкубацию проводят при 12^оС в течение 16 ч. Лигированную смесь фрагментов ДНК вводят в клетки E. coli НВ101 способом трансформации, описанным в примере 2А.

Отбор рекомбинантных клонов проводят после высевания суспензии клеток на чашки с ампициллином (50 мкг/мл). Из клонов выделяют плазмиды, анализируют продукты их гидролиза, полученные при совместном действии рестриктаз EcoRI и ScaI. Выбирают плазмиду, имеющую искомую конструкцию и обозначают ее как pSOM 3-13-5.

В. Конструирование целевой плазмиды.

Из плазмиды pCMRI^- (пример 2А) и плазмиды pSOM 3-13-5 (пример 2В) конструируют целевую плазмиду.

Из плазмиды pCMRI^-, имеющей два места действия рестриктазы ScaI, выщепляют малый фрагмент (1389 п. н. ), содержащий укороченный с 3'-конца ген САТ. Плазмиду pSOM 3-13-5 гидролизуют рестриктазами ScaI и SmaI и выделяют большой фрагмент (3531 п. н. ), несущий ген соматостатина-14. Выделенные фрагменты смешивают и лигируют, повторяя все условия выделения фрагментов плазмидной ДНК и лигирования как в примере 1. Лигированную смесь фрагментов ДНК вводят трансформацией в клетки E. coli НВ101 с использованием метода трансформации как в примере 1. Клетки высевают на чашки с ампициллином (50 мкг/мл). Из клонов, выросших на чашках с ампициллином, выделяют плазмиду с искомой конструкцией, содержащую в своем составе гибридный ген САТ-соматостатин-14 и обозначают ее как pCCS.

Проводят анализ нуклеотидной последовательности в области узнавания рестриктазой EcoRI по методу Максама-Гилберта, который показывает, что соединенные места расщепления рестриктазой ScaI, расположенного на 3'-конце гена САТ, со Smal сайтом из полилинкера плазмиды pRK позвлит получить единую фазу трансляции при экспрессии гибридного гена САТ-соматостатин-14.

П р и м е р 3. Использование рекомбинантной плазмиды pCCS для создания штамма E. coli - продуцента соматостатина-14.

Плазмиду pCCS вводят трансформацией в штамм E. coli MKD 3207 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм - продуцент сомматостатина-14.

Штамм MKD 3207 характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические.

Штамм MKD 3207 (Escherichia coli K 12) - грамотрицательные, малоподвижные палочки, при неблагоприятных условиях образующие филаменты. Штамм хорошо растет в температурном интервале 30-42^оС на богатых средах типа бульона и агара Хоттингера, а также МПБ и МПА, и на синтетических средах с добавками, компенсирующими ауксотрофные мутации.

На богатых средах образуются гладкие, с ровными краями колонии, которые со временем ослизняются, что обусловливается lon-мутацией. При температуре инкубации 40-42^оС ослизнения колоний не происходит. При росте на синтетической среде с добавками колонии всегда слизистые.

Генетические и физиолого-биохимические.

Штамм MKD 3207 имеет следующие генетические маркеры: F^-lac Y, sup E, gal 6, xyl 4, mal A1, arg H, his', lon^-, apr 24, rpl и относится к женскому типу. Устойчив к стрептомицину, не сбраживает лактозы, галактозы, ксилозы и мальтозы.

Штамм растет на синтетической среде с добавками глюкозы, аргинина и гистидина.

Штамм MKD 3207, содержащий плазмиду pCCS, приобретает устойчивость к ампициллину.

Проводят анализ экспрессии гена, кодирующего соматостатин в составе гибридного белка в клетках E. coli MKD 3207. Гибридный ген в составе экспрессирующего вектора pCCS в клетках E. coli MKD 3207 направляет конститутивный синтез гибридного белка под контролем собственного промотора CAT-P_cat.

Клетки E. coli MKD 3207, трансформированные плазмидой pCCS, выращивают в среде LB, содержащей ампициллин (50 мкг/мл) до плотности OD₆₆₀ 1,8-2,0 при 37^оС в течение 18 ч. В качестве контроля используют векторную плазмиду pBR 325 и плазмиду pCMRI^-, кодирующие нативный белок САТ под контролем собственного промотора Р_cat, как и в гибридном белке. Из 1,5 мл клеточной культуры получают осадок клеток центрифугированием. Осадок суспендируют в 20 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ трис-НСl, рН 6,8, 10% глицерин, 2% SDS, 2% 2 меркаптоэтанол. Суспензию кипятят 5 мин и анализируют с помощью электрофореза в 15% SDS ПААГ. Результаты показывают наличие доминирующей полосы в области молекулярного веса 24 кД. Уровень экспрессии гибридного белка составляет 5% от общих белков бактериальной клетки.

П р и м е р 4. Выявление соматостатина в клетках E. coli. А. Выделение гибридного белка.

Клетки E. coli MKD 3207, трансформированные плазмидой pCCS, культивируют в среде LВ, содержащей ампициллин (50 мкг/мл) при 37^оС в течение 6-7 ч 10 л ферментере до плотности OD₅₅₀ 2,0-2,5. Клетки осаждают центрифугированием 5000 g 10 мин.

Осадок клеток суспендируют в буфере трис-НСl рН 8,0, содержащем 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА из расчета 38 мл буфера на 1 л клеточной культуры. Добавляют лизоцим до конечной концентрации 0,2 мг/мл и инкубируют суспензию во льду. Экстракт замораживают и оттаивают при 37^оС в водяной бане. Клетки разрушают ультразвуком. Осадок, включающий водонерастворимый гибридный белок, получают центрифугированием 1200g 5 мин при 4^оС, промывают буфером с 0,5% тритоном Х-100 (50 мМ трис-НСl рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,5% тритон Х-100), повторно центрифугируют и осадок ресуспендируют в первоначальном буфере. Отбирают аликвоты по 10-15 мкл и анализируют 15% SDS-ПААГ электрофорезом. Обнаруживают доминантную полосу в области мол. м. 24 кД, соответствующую гибридному белку и составляющую 70-80% от общих белков осадка.

Б. Получение соматостатина.

Очищенный по примеру 4А гибридный белок растворяют в буфере 0,2 М трис-НСl рН 8,0, содержащем 6М гуанидинхлорид и 2 мМ ЭДТА. Добавляют 50-кратный молярный избыток дитиотрейтола в расчете на S-S группы гибридного белка и раствор диализуют в течение ночи против 0,01 М NH₄HCO₃. Образовавшийся преципитат гибридного белка отделяют центрифугированием 1200g 15 мин при +4^оС и используют для расщепления бромистым цианом.

Осадок гибридного белка растворяют в 70% муравьиной кислоте и добавляют кристаллический бромистый циан (2 мг/мг белка). Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 20 ч. Полноту гидролизу контролируют с помощью 9-26% SDS-ПААГ электрофореза.

Смесь пептидов, образующихся после расщепления бромистым цианом, фракционируют на сефадексе G-50. Идентификацию соматостатина в объединенных в соответствии с хроматографическим профилем фракциях после их предварительного обессоливания проводят с помощью радиоиммунологического анализа, используя наборы фирмы Incstar (США). Фракции, содержащие соматостатин, очищают при помощи обращенно-фазовой хроматографии с использованием колонки "Диасорб" С 16 (4х50 мм, размер зерна - 8 мкм).

Пептиды, имеющие иммунореактивность соматостатина, собирают, замораживают, высушивают лиофильно и используют для определения N-концевой аминокислоты при помощи дансилхлорида и аминокислотного анализа. Результаты аминокислотного анализа представлены в таблице.

Выход соматостатина составляет 1 мг на 1 л бактериальной культуры. Иммунохимическая чистота препарата по данным радиоиммунологического анализа превышает 85% и соответствует коммерческому препарату фирмы "Sigma" (США).

(56) 1. ЕР N 0001929, кл. C 12 N 15/00, 1979.

2. ЕР N 0160190, кл. C 12 N 15/00, 1986.

3. ЕР N 0108045, кл. C 12 N 15/00, 1983.

4. ЕР N 0036776, кл. C 12 N 15/00, 1981.

5. ЕР N 0197558, кл. C 12 N 15/00, 1986.

6. Патент US N 4426437, кл. 435/317, 1984.

7. СН 662128, кл. C 12 N 15/00, 1987.

Использование: в ликероводочной промышленности и может быть использовано для получения алкогольных напитков крепостью 40% . Сущность изобретения состоит в том, что композиция ингредиентов для получения настойки горькой состоит из следующих компонентов, кг/1000 дал: аир (корень) 0,9 - 1,1; зверобой 2,7 - 2,9; женьшень (надземная часть) 0,5 - 0,7; календула 1,0 - 1,2; миррис душистая 3,0 - 3,2; пижма бальзамическая 2,5 - 2,7; ромашка лекарственная 3,8 - 4,0; сахар 20,0 - 20,4; колер 2,0 - 2,2; водно-спиртовая жидкость остальное. 1 ил, 1 табл.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pccS, кодирующая соматостатин-14, размером 4920 п. н. , содержащая:
- фрагмент плазмидного вектора pBR 325 размером 4860 п. н. , включающий часть гена устойчивости к тетрациклину с сайтом рестрикции Bam HI на 5'-конце, ген устойчивости к ампициллину, часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы с полусайтом рестрикции
ScaI на 3'-конце и элиминированным сайтом рестрикции Eco RI;
- синтетический ген соматостатина со стоп-кодоном, фланкированный Eco RI - Bam HI сайтами рестрикции, размером 58 п. н. ;
- фрагмент линкера, содержащий сайт рестрикции Eco RI и фланкированный с 5'-конца нуклеотидной последовательностью GG для сочленения гена соматостатина с
3'-концом гена хлорамфениколацетилтрансферазы;
- генетические маркеры:
- ген Ap^r - ген устойчивости к ампициллину;
- уникальные сайты рестрикции, расположенные по часовой стрелке от Bam HI сайта: Bam HI, Sal I, Sph I, Nru I, Ava I, Nde I, Ssp I, Pst I, Pm I, Sca I, Eco 0109, Nco I, Eco RI. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В 5557 - продуцент соматостатина-14.