СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству-гинекологии, и может быть использовано для пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденного.

Известен способ пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденного путем определения содержания билирубина в околоплодных водах с помощью трансабдоминального амниоцентеза. Это исследование выполняется по следующим показаниям: титр антител выше критического уровня или увеличение на 2 разведения титра антител при отсутствии отягощенного анамнеза, антитела вне зависимости от их титра при наличии в анамнезе мертворождения или тяжело больного ребенка, а также данные неинвазивных методов исследования, свидетельствующие о наличии у плода среднетяжелой или тяжелой формы гемолитической болезни (В.М.Сидельникова, А.Г.Антонов. Гемолитическая болезнь плода и новорожденного. - М.: Триада-Х, 2004. - стр.67-71).

Недостаток способа: инвазивность.

Известен способ пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденного путем определения динамики титра антител в крови матери (В.М.Сидельникова, А.Г.Антонов. Гемолитическая болезнь плода и новорожденного. - М.: Триада-Х, 2004. - стр.45-47).

Недостатки способа: имеет низкое прогностическое значение в связи с тем, что во многих случаях при выраженной сенсибилизации и даже при нарастании титра антител рождается ребенок с резус-отрицательной кровью. А также титр антител не может служить достоверным показателем тяжести заболевания, так как известно, что при низком титре антител могут рождаться мертвые или тяжелобольные дети и, напротив, при высоком титре - здоровые.

Изобретение направлено на решение задачи: повышение точности пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденного.

Технический результат: ранняя профилактика и лечение гемолитической болезни новорожденного.

Указанная задача решается путем оценки пролиферативной активности лимфоцитов беременной женщины на лимфоидные клетки генетического отца ребенка, расчета индекса стимуляции (ИС), и при его величине более или равно 2,5 диагностируют заболевание.

Способ осуществляют следующим образом. У резус-отрицательной беременной женщины в сроке 32-34 недели и у резус-положительного генетического отца будущего ребенка из вены производят забор 20 мл крови. Гепаринизированную венозную кровь отстаивают в течение 2 часов при температуре 37°С. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимают и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования осадок ресуспендируют в 2 мл полной питательной среды. Лейкоциты беременных женщин культивируют с фитогемагглютинином Р (ФГА «Sigma», конечная концентрация в клеточной культуре составляла 20 мкг/мл) либо лимфоидными клетками ее мужа (2х10 клеток мужа инкубируют с митомицином С 50 мкг/мл в течение 30 мин для подавления их митотической активности) в 96-лунночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2х10 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 мM HEPES («Sigma»), 2 мM L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы. Культивирование осуществляют во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37°С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи3 Н-тимедина («Изотоп», Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждают на фильтровальную бумагу при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм. Фильтры промывают для удаления несвязавшегося тимедина 5 мл 0,85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4°С 5% трихлоуксусной кислоты и 5 мл 0,85% NaCl. Радиоактивность проб определяют на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (Wallas, Финляндия).

Индекс стимуляции (ИС) рассчитывают по формуле: ИС= опыт/контроль. При величине ИС равно или более 2,5 диагностируют заболевание.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Беременная X., 19 лет, первобеременная, первородящая, история родов №690. Имеет группу крови 0(I), резус фактор Rh(-), муж 0(I), Rh(+). Беременность протекала на фоне раннего токсикоза легкой степени, железодефицитной анемии первой степени. Данные фетометрии за весь период беременности соответствовали срокам гестации. Количество околоплодных вод было нормальным. Антитрезусные антитела за всю беременность выявлены не были.

Проводили оценку пролиферативной активности лимфоцитов беременной женщины на лимфоидные клетки генетического отца ребенка. Способ осуществляют следующим образом. У резус-отрицательной беременной женщины в сроке 32-34 недели и у резус-положительного генетического отца будущего ребенка из вены производят забор 20 мл крови. Гепаринизированную венозную кровь отстаивают в течение 2 часов при температуре 37°С. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимают и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования осадок ресуспендируют в 2 мл полной питательной среды. Лейкоциты беременных женщин культивируют с фитогемагглютинином Р (ФГА «Sigma», конечная концентрация в клеточной культуре составляла 20 мкг/мл) либо лимфоидными клетками ее мужа (2х10 клеток мужа инкубируют с митомицином С 50 мкг/мл в течение 30 мин для подавления их митотической активности) в 96-лунночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2х10 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 мM HEPES («Sigma»), 2 мM L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы. Культивирование осуществляют во влажной атмосфере с 5% CO₂ при 37°С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи3 Н-тимедина («Изотоп», Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждают на фильтровальную бумагу при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм. Фильтры промывают для удаления несвязавшегося тимедина 5 мл 0,85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4°С 5% трихлоуксусной кислоты и 5 мл 0,85% NaCl. Радиоактивность проб определяют на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (Wallas, Финляндия). Индекс стимуляции (ИС)=2,5.

Роды срочные, самопроизвольные, общей продолжительностью 14 час 50 мин. Безводный период составлял 5 час. Околоплодные воды светлые, послед без особенностей. Родилась доношенная девочка массой 3860 г, длиной 52 см, оценка по шкале Апгар составляла 8/9 бал., с 0(I), Rh(+).

На 1-е сутки после родов у младенца развилась желтуха, билирубин крови составил 115,2 мкмоль/л. Был выставлен диагноз гемолитическая болезнь новорожденного по системе резус, желтушная форма средней степени тяжести, что явилось показанием для проведения фототерапии.

Пример 2.

Беременная К., 29, первобеременная, первородящая, история родов №2469. Имеет группу крови 0(I), резус фактор Rh(-), муж А(II), Rh(+). Беременность протекала на фоне угрозы прерывания с ранних сроков, по поводу чего получала лечение: дюфастон, спазмолитики, гинипрал (с 24 нед.). Данные фетометрии за весь период беременности соответствовали срокам гестации.

Количество околоплодных вод было нормальным. Антитрезусные антитела за всю беременность выявлены не были.

Проводили оценку пролиферативной активности лимфоцитов беременной женщины на лимфоидные клетки генетического отца ребенка. Способ осуществляют следующим образом. У резус-отрицательной беременной женщины в сроке 32-34 недели и у резус-положительного генетического отца будущего ребенка из вены производят забор 20 мл крови. Гепаринизированную венозную кровь отстаивают в течение 2 часов при температуре 37°С. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимают и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования осадок ресуспендируют в 2 мл полной питательной среды. Лейкоциты беременных женщин культивируют с фитогемагглютинином Р (ФГА «Sigma», конечная концентрация в клеточной культуре составляла 20 мкг/мл) либо лимфоидными клетками ее мужа (2х10 клеток мужа инкубируют с митомицином С 50 мкг/мл в течение 30 мин для подавления их митотической активности) в 96-лунночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2х10 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 мM HEPES («Sigma»), 2 мM L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы. Культивирование осуществляют во влажной атмосфере с 5% CO₂ при 37°С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи3 Н-тимедина («Изотоп», Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждают на фильтровальную бумагу при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм. Фильтры промывают для удаления несвязавшегося тимедина 5 мл 0,85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4°С 5% трихлоуксусной кислоты и 5 мл 0,85% NaCl. Радиоактивность проб определяют на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (Wallas, Финляндия). Индекс стимуляции (ИС)=0,96.

Роды срочные, самопроизвольные, общей продолжительностью 8 час. 05 мин. Околоплодные воды светлые, послед без особенностей. Родился доношенный, здоровый мальчик массой 3130 г, длиной 50 см, оценка по шкале Апгар составляла 8/9 бал., с A(II), Rh(+).

Послеродовый период протекал без особенностей. Билирубин крови составлял 26,4-40,8 мкмоль/л.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности оценки пролиферативного ответа лимфоцитов беременной женщины на антигены отца будущего ребенка с целью своевременной диагностики развития гемолитической болезни новорожденного.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии. Сущность способа диагностики гемолитической болезни новорожденных заключается в том, что исследуют кровь матери на 32-34 неделе гестации, при этом лимфоциты беременной женщины культивируют в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка, оценивают уровень пролиферации лимфоцитов матери, стимулированных аллогенными лимфоцитами, рассчитывают индекс стимуляции и при его величине равной или больше 2,5 диагностируют заболевание. Использование способа позволяет повысить точность пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденного.

Способ диагностики гемолитической болезни новорожденных путем исследования крови матери, отличающийся тем, что на 32-34 неделе гестации лимфоциты беременной женщины культивируют в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка, оценивают уровень пролиферации лимфоцитов матери, стимулированных аллогенными лимфоцитами, рассчитывают индекс стимуляции, и при его величине равной или больше 2,5 диагностируют заболевание.