Способ отбора сортов и линий гороха с высоким содержанием триптофана Советский патент 1990 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к лиотехноло- гии, в частности к селекции растений, и может быть использовано для созда- ния сортов с высоким содержанием незаменимых аминокислот, в частности триптофана.

Цель изобретения - ускорение анализа и снижение его трудоемкости.

Способ состоит в том, что оценку растений гороха на повышенное содержание триптофана ведут по наличию пероксидаз с относительной электро- форетической подвижностью 0,09-0,12 и/или эстераз с относительной элект- рофоретической подвижностью 0,67- 0,70.

1 Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Берут 2 г семян гороха сорта Feton. Семена очищают от семенной оболочки и зародыша, размалывают на электрической лабораторной мельнице Пируэт, обезжиривают. Навеску муки 200 мг экстрагируют три- сцистеиновым буфером в течение 1,5 ч на холоде при постоянном помешивании. После этого центрифугируют при 8 тыс. об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант используют для электро- форетического исследования изофер- ментного спектра эстераз и пероксидаз в ПААГе. Электрофорез проводят на электрофоретическом аппарате фирмы Реанал. Трубочки, заполненные полиакриламидным (застывшим) гелем, закрепляют в электродной камере, вноСЛ

01

ЈЛ Ј

сят в них по 1 капле (0,033 мл) су- пернатанта, 1 капле сахарозы и 1 капле краски (бромфеноловый синий). Буфером для нижней и верхней электродных камер служит трисглициновый буфер (рН 8,3).

Электрофорез идет в холодильнике в течение 60 мин. Первые 1Ь мин электрофорез ведут при силе тока 2 мА на трубку, что способствует более равномерному распространению белка по всей поверхности геля. Затем устанавливают силу тока 4 мА на гель. По окончании разгонки (белок проходит по всей длине геля в трубочке) гели вынимают из трубочек, помещают в пробирки и заливают фосфатным буфером рН 6,2, который сливают через 30 мин.

5

0

Исследование компонентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с относительной электрофоретическои подвижностью (ОЭИ или Rf) U,U9, а в спектре эсте- раз 0,70. Сорт обладает высоким содер жанием триптофана.

Пример 2. Берут семена гороха сорта Rohiefo. Готовят семена и проводят электрс-форез по методике примера 1.

Исследование компонентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с ОЭП 0,10, а в спектре эстераз - компоненты с ОЭП 0,67; 0,68 и 0,70. Сорт обладает высоким содержанием триптофана.

Пример 3. Берут семена горо

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям растений, и может использоваться при создании новых сортов гороха. Целью изобретения является ускорение анализа и снижение его трудоемкости. Способ состоит в том, что проводят электрофорез изоферментов зерна гороха и затем выявляют высокотриптофановые генотипы по наличию пероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 0,09-0,12 и эстераз с ОЭП 0,67-0,70. 2 табл.

Затем гели заливают на 30 мин смесью 20 ха с°Рта Горизонт. Готовят семена

30

приготовленной следующим образом: 150 мл фосфатного буфера рН 6,2, 300 мг прочного синего, 3 мл Х-наф- тила, разведенного в 96° этиловом спирте. Эту смесь перед употреблением 25 фильтруют. Слив эту смесь, гели промывают дистиллированной водой, а затем фиксируют следующей смесью: 234 мл воды дистиллированной, 60 мл спирта, 6 мл соляной кислоты. После этого проводят подсчет белковых компонентов (изоформ) эстераз.

Дпя разгонки пероксидаз вначале проводят те же операции, что и при разгонке эстераз. Отличие в том, что после того, как гель вынимают из тру бочек, его (гель) заливают на 20 мин буфером рН 4,8, приготовленным из 4,6 мл уксусной кислоты и 16 г уксуснокислого -натрия и доведенным до 1 л дистиллированной водой. Через 20 мин гели заливают смесью, состоящей из 171 мл буфера рН 4,8,9 мл бензидина и 2,4 мл пирокатехина.

.,-35

40

и проводят электрофорез по методик примера 1.

Исследование компонентного сост показывает, что в спектре пероксид присуствуют компоненты с ОЭП 0,06, а в спектре зстераз - компоненты с ОЭП 0,08. Сорт обладает низким со держанием триптофана.

Пример 4. Берут семена го ха сорта Зерноградский многоплодны Семена готовят и проводят электрофорез по методике примера 1. В спе ре эстераз присутствуют компоненты с ОЭП 0,07 и 0,11. Сорт обладает н ким содержанием триптофана.

Характеристика сортов гороха с различным содержанием триптофана п ведена в табл.1 и 2.

К образцам с высоким содержание триптофана относят те, у которых в электрофоретическом спектре перокс даз имеются компоненты с ОЭП 0,09- 0,12 и(или).эстераз с ОЭП 0,67-0, Присутствие всех компонентов необя зательно, это может быть один или несколько компонентов, имеющих ОЭП указанных пределах.

Через 10 мин в пробирки с гелем и указанной смесью добавляют по 0,2 мл перекиси водорода (3%) и оставляют стоять гели в этой смеси 20 мин, после чего сливают, промывают дистиллированной водой и фиксируют 20%-ным этиловым спиртом.

После проводят подсчет спектра белковых компонентов (изоформ) пероксидаз и эстераз, используя миллиметровую линейку. Затем вычисляют относительную электрофоретическую подвижность каждого компонента (ОЭП или Rf).

0

5

0

5

0

5

и проводят электрофорез по методике примера 1.

Исследование компонентного состава показывает, что в спектре пероксидаз присуствуют компоненты с ОЭП 0,06, а в спектре зстераз - компоненты с ОЭП 0,08. Сорт обладает низким содержанием триптофана.

Пример 4. Берут семена гороха сорта Зерноградский многоплодный, Семена готовят и проводят электрофорез по методике примера 1. В спектре эстераз присутствуют компоненты с ОЭП 0,07 и 0,11. Сорт обладает низким содержанием триптофана.

Характеристика сортов гороха с различным содержанием триптофана приведена в табл.1 и 2.

К образцам с высоким содержанием триптофана относят те, у которых в электрофоретическом спектре пероксидаз имеются компоненты с ОЭП 0,09- 0,12 и(или).эстераз с ОЭП 0,67-0,70. Присутствие всех компонентов необязательно, это может быть один или несколько компонентов, имеющих ОЭП в указанных пределах.

Образцы с низким содержанием триптофана имеют в спектре пероксидаз компоненты с ОЭП 0,06-0,08 и(или) в спектре эстераз компоненты с ОЭП 0,04-0,12.

Исследование электрофоретического спектра пероксидаз и эстераз изучаемых сортов показало, что для сортов, обладающих повышенным содержанием триптофана, характрно наличие в спектре пероксидаз компонента с относительной электрофоретическои подвижностью (ОЭП) 0,09-0,12 (табл.1) и(или) компонента эстераз с ОЭП 0,67-0,70 (табл.2). Однако, как видно из данных табл 1 и 2, необязательно присутствие всех компонентов в указанных пределах, в том числе и их граничных значений.

Способ отбора сортов и линий гороха с высоким содержанием триптофана, включающий анализ и оценку исследуемых сортов и линий с последующим отбором по интересующему признаНаличие белкового маркера на повы-л н ч а ю щ и й с я тем

шенное.содержание триптофана дает воз JO q с ю ия анализа „ сни- можность эффективно вести оценку в питомнике исходного материала (после гибридизации, мутагенеза и т.д.), что позволяет выделить ценные генотипы на

жения его трудоемкости, анализ ведут путем электрофореза изоферментов и отбор сортов и линий с высоким содержанием триптофана осуществляют по

ранних этапах селекционного процесса. 15

держанием триптофана осуществляют по

наличию них пероксидаз с относи- Использование предлагаемого спосо- тельной электрофоретической подвиж- ба оценки растений гороха на повышен- ностью 0,09-0,12 и/или эстераэ с от- ное содержание триптофана по срав- носительной электрофоретической под- нению с известным сокращает время на 20 вижностью 0,67-0,70.

Таблица

Количество триптофана, мг на 100 г сухого вещества

Местный Львовск.обл. 200 ++ --Горизонт200- +

Пелюшка местная210-- + - - - - Грузия210 + - Premier213 + +

Зерноградск. многогш.222 -.

Varee23Ь 4----Frosen307 +

Kohiafo315-- - - - +

Ulinpie316- - - - - +

Kuhm von Bran337 + -

GloBhofs aval348. «.

Feton35b +

Wan. w. titan375 +-+ -- -- - -- - ------«--.---- ----- --.-----.-------------- ------------------------ -- ---------

Примечание. (+) - компонент присутствует, (-) - компонент отсутствует.

Таблица 2

Сорт КоличествоОтносительная электрофоретичесКЁЯ подвижность

триптофа-

на, мг на O.U3 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 ... 0,66 0,67 0,68 0,69 0,70 0,71 100 г сухого вещества

Местный Лыюнск.

обл.200-- -- - ---------Горизонт200 - + ---.-------Пелюшка местная210- + --.------------Грузия210- + 4.-------------Premier213- - + --.--------Зерноградск.

многопл,222---..4--- -------- Varce235 ---- --- + ------Froaen307..----- -- +

Rohiefo315..--------- + -

Olympic316.- ----- --Ruiirn von Bran337 ------.------ + + urofihofs Rival348 --- ---------- + Feton355..------------«

., titan375 - - r . - .

ГГр и м e ч а ниe. ()хомпочент присутствует; (-) - компонент отсутствует.

Составитель В.Демкин Редактор М.Недолуженко Техред1 М.Ходанич Корректор О.Ципле

Заказ 670Тираж 436Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5

- «ee-eeee le . ..- .„ ««« W «... Ml ..«.„ ии...™.. W. -.-. - -- «-™..---и.«в.ч„.- и.-.-.--- ,

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

создание нового сорта, снижает трудоемкость селекционного процесса . Формула изобретения

Способ отбора сортов и линий гороха с высоким содержанием триптофана, включающий анализ и оценку исследуемых сортов и линий с последующим отбором по интересующему признал н ч а ю щ и й с я тем

q с ю ия анализа „ сни-

жения его трудоемкости, анализ ведут путем электрофореза изоферментов и отбор сортов и линий с высоким соq с ю ия анализа „ сни-

держанием триптофана осуществляют по

Относительная электрофоретическая подвижность

.„.1т-,р0,05 .0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 О,

.„ - 1-- -J - L----1-.--,---.I-

12