Способ определения активности изопероксидаз Советский патент 1988 года по МПК C12N9/42 G01N33/48 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биологической химии и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экснресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека.

ценную вытяжку используют для электро- форетического разделения изопероксидаз. В карман геля наносят строго определенное количество белкового материала (в пределах 25-35 мкг). После электрофореза гель разрезают так, чтобы две пробы одного и того же образца оказались в двух разных половинках геля. Одну из них выдерживают 30 мин в 0,02%-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М ацеi Цель изобретения - повышение избирательности и чувствительности определения.

Сущность изобретения заключается в том,

что после электрофоретического разделенияю татном буфере, рН 4,7, а затем до проявления

в полиакриламидном геле удельную актив-синих полос в 0,1%-ном растворе перекиси

ность изопероксидаз и содержание в нихводорода. Другую часть геля окрашивают

белка определяют десинтометрически послена белок серебряным реагентом. Затем обе

обработки соответствующими реагентами ичасти геля сканируют с помощью лазернорасчет удельной активности проводят на ос-го денситометра и рассчитывают площадь

нове калибровочных графиков, построенных 5 получаемых пиков. По калибровочным грапо стандартному препарату пероксидазы.фикам, составленным по стандартному преПример I. Навеску 0,2 г растительногопарату пероксидазы из хрена, определяют

материала растирают в 1 мл холодного трис-активность каждого изофермента в пикокатагпицинового буфера, рН 8,3, содержащеголах, а также количество белка в мкг в

м% сахарозы, в фарфоровой ступке в те-2о зонах, проявивших пероксидазную активчение 3 мин, выдерживают в холодильни-ность с последующим расчетом удельной акке (4-6°С) в течение 30 мин и центрифуги-тивности в пикокаталах на мкг белка

руют при 10000 g в течение 20 мин. Полу-(табл. 1, 2, 3).

ценную вытяжку используют для электро- форетического разделения изопероксидаз. В карман геля наносят строго определенное количество белкового материала (в пределах 25-35 мкг). После электрофореза гель разрезают так, чтобы две пробы одного и того же образца оказались в двух разных половинках геля. Одну из них выдерживают 30 мин в 0,02%-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М аце татном буфере, рН 4,7, а затем до проявления

Изобретение относится к молекулярной биологии и биологической химий и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностики- состояния растений, животных и человека. С целью повышения избирательности и чувствительности определения, электрофоретичес- кое разделение белков из вытяжки пероксидаз, полученных из проростков пшеницы и кукурузы, осуществляют на 2-х параллельных дорожках в полиакриламидном геле толщиной 1 мм. Полученную гелевую пластинку разделяют на 2 части таким образом, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают 30 мин в 0,02%-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М аце- татном буфере рН 4,7, а затем до появления синих полос в 0,1%-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоре- тической зоне по площадям пиков. Преимущество способа заключается в упрощении определения активности изопероксидаз за счет исключения многоэтапной очистки и получении информации об удельной активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многоком.понентной смеси изофермен- тов из вытяжки проростков растений. 3 табл. SP СЛ

Т а б .п и ц а 1

Расчет удельной активности анодных изопероксидаз проростков кукурузы

Днепровский 247 Ж

Примечание. S- площадь пика ; пкат - пикокаталы, ОЭП - относительная электрофоретическая активность.

1423587

Таблица 2

Расчет удельной активности анодных изопероксидаз листьев озимой

пшеницы Альбидум 114

Примечание. S- площадь пика: пкат - пикокаталы.

Таблица 3

Соотношение относительной активности и удельной активности изопероксидаз

% и к их сумме

Преимущество предлагаемого способа заключается в упрощении способа определения активности изопероксидаз и активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многокомпонентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений.

Формула изобретения

Способ определения активности изопероксидаз, включающий инкубирование проб в растворах субстрата и перекиси водорода, электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью

45 повышения избирательности и чувствительности определения, полученную гелевую пластинку разделяют на две части так, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают реагентом для выявления зон фер50 ментативной активности, а другую прокращи- вают на белок серебряным реактивом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой элек трофоретической зоне по площадям пиков.