Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/32 

субстрат и систему тетразолюма с присутствием феназин-метасульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле.

Недостатком данного способа является то, что он не дает возможность определения алкогольдегидрогеназы и лактатдегидроге- назы.

Цель изобретения - расширение диапазона определяемых изоферментов в персиковом растении.

Поставленная цель достигается тем, что частично очищенный препарат ферментов наносят на полиакриламидный гель (20%).

В качестве буферных систем применяют маточную-буферную систему в составе: Трис-215г, ЕДТА-18г, Нз ВОз-ПОг, НаО до 2,5 л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера. . Г

При этом для идентификации алкогольдегидрогеназы (АДГ) (Е.С. 1.1.1.1) в качестве красящего раствора используют: Трис HCI буфер рН 8,5 7 мл + 28 мл Н20, НАД - 25 мл, МТТ - 25 мл, ФМС 3 мг + 5 мл спирта.

Для идентификации лактатдегидроге- назы (ЛДГ) (Е.С. 1.1.1.27) применяют фосфатный буфер в составе 0,5 м рН 7,4-7 мл + 28 мл HiO, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2 мг, MIT -J5 мг, - 15 мг.

Заявленный способ отличается от прототипа составом буферных систем и содержанием красящих растворов, что дает возможность дополнительно к известным дегидрогеназам прибавить еще два изофер- мента АДГ(ЕС 1.1.1.1) и ЛДГ (ЕС 1.1.1.27).

Эффект достигается за счет того, что обнаружение алкогольдегидрогеназы и лак- татдегидрогеназы позволяет расширить генетическую информацию о персиковом растении и облегчает селекционную работу с этой культурой.

На фиг.1 изображены электрофоретиче- ские спектры АДГ из листьев персика, сорта: Картули сапоби (1; 2) и Беставашвили (3; 4); на фиг.2 - электрофоретические спектры ЛДГ из листьев персика, сорта: Картули сапоби (1; 2) и Беставашвили (3; 4).

Способ осуществляется следующим образом: В качестве исходного материала используют хорошо развитые,зеленые листья однолетнего побега 5-го, 6-го порядка. Образцы для исследования используют в 1-10 дневный срок/храня их при температуре+4,

+5°С.

Для гомогенизации используют раствор в составе: 36 гсахарозы,106 г аскорбиновой к-ты, 94 г цистейн гидрохлбрида, до 100 мг гелевого буфера. Раствор фильтруют. При

растирании образцов добавляют битое стекло. Материал центрифугируют в течении 20-30 мин. При скорости вращения 20000 об/мин.

Частично очищенные препараты дегид- рогеназ листьев персика наносят на полиак- риламидный гель (20%), проводят электрофорез при постоянном электрическом токе 220 Вольт при температуре +4,

0 +9°С.

В качестве буферных систем применяют маточную буферную систему в составе: Трис

- 215 г, ЕДТА - 18 г, НзВОз - 110 г, Had до 2,5л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7 для 5 электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера.

В качестве красителей используют 3 (4,5

- диметилтиазолил 1-2) 2,5 - дефенил - тет- разолий - бромид (МТТ) в присутствии фе- 0 назинметасульфата (ФМС).

П р и м е р 1. Определение алкогольдегидрогеназы (Е,С. 1.1,1.1). Суммарный препарат на геле помещают в кювету с раствором, содержащим: Трис HCI буфер 5 рН 8,5-7 мл + 28 мл НаО

НАД...25мг

МТТ...25мг

ФМС ... 3 мг + 5 мл спирт.

Выдерживают в термостате при 37°С в 0 течение 12 ч. Окрашенный препарат фиксируют в 10%-ной уксусной кислоте.

П р и м е р 2. Определение лактатдегид- рогеназы (ЕС. 1.1.1.27). Суммарный препарат на геле помещают в кювету с раствором, 5 содержащим:

Фосфатный буфер 0,5 м рН 7,4-7 мл + 28 мл Н20

Лактат натрия ... 550 мг

ФМС ... 2 мг 0МТТ... 15мг

... 15мг.

Время проявления 1 час, при 37°С в термостате, фиксируют в 10% уксусной кислоте,

5 Результаты опыта. Объектом исследования служили Грузинские сорта персика Картули сапоби и Беставашвили. Для проведения анализа на участке (в Горий- ском районе) с каждого сорта выбирали по 0 35-40 деревьев, Опыты проводились летом (июль) 1989 года и осенью (октябрь) 1990 года.

На фиг.1 и 2 приведены полученные электрофоретические спектры АДГ и ЛДГ. 5 Алкогольдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.1) в листьях обоих Грузинских сортов персика представлена тремя компонентами: Rf 0,12; 0,23 и 0,40 (см. фиг.1). Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линии составляли 1,2; 2,3; 4,0 см соответственно

для каждой Rf. По числу и подвижности компонентов эти сорта между собой не отличались. Однако активность фермента у сорта Беставашвили по компоненту Rf 0,12 была выше, чем у сорта Картули сапоби.

Лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27) в листьях сорта Картули сапоби представлена двумя компонентами (см. фиг.2) Rf 0,20 и 0,40. Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линии составляли 2,0 и 4,0 см соответственно. В листьях сорта Беставашвили ЛДГ представлена тремя компонентами-Rf 0,20; 0,33 иО,44. Средняя миграционная дистанция от начальной линии 2,0; 3,3 и 4,4 см соответственно для каждой Rf.

При изучении индивидуальной изменчивости обнаружено, что различные деревья одного сорта в основном не отличаются по компонентному составу по АДГ и ЛДГ. Электрофоретические спектры были стабильными в течение всего периода вегетации. Осенью активность ферментов уменьшалась.

Предложенный способ позволяет определить дополнительно два изофермента, в частности АДГ и ЛДГ, чем достигается расширение диапазона генетической информации определяемых изоферментов, что имеет

0

большое значение для генетической и селекционной работы с культурой персика. Формула изобретения Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения, включающий приготовление частично очищенного препарата ферментов из листьев, нанесение его на гель, проведение электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, субстрат и систему тет- разолюма с присутствием феназинмета- сульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле, отличающийся тем, что нанесение препарата 5 осуществляют на 20%-ный полиакриламид- ный гель, а в качестве буферных систем используют маточный буфер в составе Трис - 215 г, ЕДТА-18г, НзВОз-ПОг, Н20до2,5 л с рН 8,3, разводимый водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера, при этом в качестве красящих растворов используют Трис HCI буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, НАД - 2 мг, МТТ - 2 мг, ФМС - 3 мг + 5 мл спирта для идентификации алкогольдегид- рогеназы и фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл + 28 мл НаО, лактат натрия 550мл, ФМС-2 мг, МТТ- 15мг, 15 мг для идентификации лактатдегидрогена- зы.

0

5

0

Использование: область биохимической генетики, способы определения изоферментов - дигедрогеназ в листьях персикового растения. Сущность изобретения: способ включает нанесение препарата ферментов на 20% полиакриламидный гель и использование в качестве буферных систем составов - Трис - 215 г, ЕДТА - 18 г, НзВОз - 110 г, НаО до 2,5 л с рН 8,3, разведенных водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера. В качестве красящих растворов используют Трис HCI буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, НАД -2 мг, МТТ - 2 мг, ФМС - 3 мг плюс 5 мл спирта для идентификации алкогольде- гидрогеназы. Для идентификации лактатде- гидрогеназы используют состав: фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2 мг, МТТ- 15мг и 15 мг. 2 ил. Недостатком указанного способа является то, что он позволяет определять сравнительно малую часть изоферментных систем в растении персика. Известен способ определения дегидро- геназ в листьях персикового растения (прототип), состоящий из приготовления частично очищенного препарата ферментов, нанесения его на гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, VJ 00 00 о о ю (л

.0.0-1 0.12

RЈ 0.23 0.2

0.3

Rf O.fO 1О.И

0.5 0,6 0.7