Способ идентификации сортов сахарной свеклы Советский патент 1989 года по МПК A01H1/04 

1 .

Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры.

Цель изобретения - повыщение точности и надежности идентификации сортов сахарной свеклы.

На фиг. 1 представлено 1 1 типов спектров глобулинов, выявленных у 3-сортов сахарной свеклы; на фиг. 2 - эталонный элект- рофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы.

Способ осуществляется следующим образом.

У изучаемого сорта отбирают 100 семян без околоплодника. Каждое семя помещают

в пробирку, тщательно раздавливают его стеклянной палочкой и заливают 0,2 м 1 Л NaCl для экстракции суммарных белков (альбуминов и глобулинов), которую проводят в течении ночи (15-16 ч). Затем глобулины осаждают из суммарного белкового экстракта охлажденной дистиллированной водой (методом криопреципитации).

Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента: 1°/о-ный додецилсульфат натрия и 5°/о-ный 2-меркап- тоэтанол. Полученные глобулины фракционируют с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламИД- НОМ геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Глобулины диссоциируют до полипептидов в нагретом до 100°С 0,25М трнс-НС1

4

Од

00 ;о

буфере (рН 6, 8), содержащем 1°/о-ный до- децилсульфат натрия и 5%-ный 2-меркап- гоэтанол. Продолжительность электрофореза 3 ч при силе тока 50 мА на пластину и напряжении 200 В. Электрофорез осущест- вляют в вертикальных пластинах. I В табл. 1--3 приведены данные результатов испытания режимов экстракции и электрофоретического фракционирования глобулинов, позволивших получить четкие и многокомпонентные спектры.

В табл. 1 приведены результаты изучения (электрофоретических спектров, полученных {при фракционировании глобулинов семян са- |харной свеклы с околоплодником и без него. I Как видно из приведенных данных, ис- пользование для экстракции глобулинов се- мян без околоплодника позволяет получать электрофоретические спектры более четкие |и с большим числом компонентов, чем для |глобулинов семян с околоплодником.

I В табл. 2 показано влияние условий экст- рагирования и продолжительности электро- |форетического фракционирования на полно- ;ту извлечения компонентов глобулинов из |семян сахарной свеклы сорта Белоцерковс- кая односеменная 34.

: Из приведенных данных видно что объем экстрагирующего буфера 0,1 мл не достаточен для проявления субъединиц глобулинов с Rf 0,02, 0,10, 0,18, 0,21, 0,26, 0,35, :0,75. Объем - 0,3 мл - великоват, поэтому i на электрофоретических спектрах зоны с Rf |0,42 и 0,64 плохо разделяются. Вместе с тем I при использовании для экстрагирования бел- ков 0,2 мл буфера были получены четкие электрофоретические спектры с 23 компонентами.

Из табл. 2 видно также, как влияет продолжительность экстракции на качество получаемых электрофоретических спектров. Часовая и трехчасовая экстрации не достаточны для извлечения из одного семени всех субъединиц глобулинов. Только экстрагирование белков в течение ночи (15-16 ч) обеспечило получение электрофоретических спектров с наибольшим числом компонентов (23).

При трехчасовой (сокращенной) продол- жительности электрофореза получен электро- форетический спектр с 23 компонентами. При продолжительности разгонки 7 ч часть субъединиц глобулинов свеклы (Rf 0,73, 0,76, 0,78, 0,82, 0,87, 0,92, 0,96) выходит из геля.

Следовательно, наибольшее число компо- нентов в спектрах обнаружено при использовании объема экстрагирующего буфера 0,2 мл, продолжительности экстракции «на ночь, продолжительности электрофореза 3 ч.

В табл. 3 представлены результаты сравнения электрофоретических спектров глобулинов, описанных известным и предлагаемым способами.

Как видно из табл. 3 электрофоретические спектры суммарных белков в нативной системе геля имеют в своем составе только 6 компонентов глобулинов: три из них основные (Rf 0,13, 0,20, 0,28), а три минорные (Rf 0,03, 0,09, 0,48). Применение одного дезагрегирующего агента (SDS) повыщает разрешаюп1ую способность фракционирования глобулинов (12 компонентов). Но она все же недостаточна. Введение двух дезаг- регирующ.их агентов - SDS и 2-меркапто- этанола - значительно улучшает электрофо- ретическое фракционирование и позволяет получить четкое разделение 23 субъединиц глобулинов.

Предлагаемым способом изучено три сорта сахарной свеклы: Белоцерковская односеменная 45 (ВЦ 45), Веселоподолянс- кая 29 (ВП29), Индустриальная. В каждом сорте проанализировано от 100 до 150 семян. При этом выявлено 11 типов спектров глобулинов (фиг.. 1), которые различаются числом компонентов в спектре, интенсивностью окраски и относительной электрофо- ретической подвижностью некоторых компонентов.

Полученные Эv eктpoфopeтичecкиe спектры изучаемого сорта (100 спектров) записывают в виде белковых формул при сравнении их с эталонным электрофоретическим спектром глобулинов сахарной свеклы. Эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы представлен на фиг. 2, его белковая формула оС 123 ft (1)23456 у 12345678910 W 123(4)56789.

В табл. 4 представлены белковые формулы 11 типов спектров, обнаруженных у трех сортов сахарной свеклы.

Записанные в виде белковых формул электрофоретические спектры глобулинов отдельных семян разделяют на группы по типам спектров и определяют частоту их встречаемости для каждого сорта в данной выборке семян.

Спектры изученных сортов сахарной свеклы приведены в таб.т. 5.

Как видно из табл. 5. сорт ВЦ 45 имеет следуюыдие типы спектров: 3, 4, 6. 7, 8, 9, 10, 11; сорт ВП29 - спектры 1, 2, 3, 5, 6. 7, 8. а сорт Индустриальный - спектры 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Некоторые типы спектров обнаружены только у сорта Белоцерковской селекции - 9, 10, 11, а спектры 1, 2, 5 - только у сортов ВП29 и Индустриальный.

Из данных табл. 5 видно также что каждый сорт характеризуется неодинаковым распределением частот встречаемости основных типов спектров. Так, наиболее часто встречаемым спектром у сорта БП 45 является спектр 9 (35, 60%), а наиболее редко встречаемым - спектр 6 (4, ), который однако у сорта ВП29 встречается чаще других (32,30%). Для сорта Индустриальный наиболее часто встречаемым является спектр 1 (26, 60%).

Таким .образом, каждый сорт отличается от другого не только наличием разных типов спектров, но и частотой их встречаемости. При этом каждый сорт имеет наиболее характерный для него тип спектра (наиболее часто встречаемый). Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что различия между сортами достоверны - НСР 0,05 0,136.

Такая характеристика сорта может быть наглядно представлена в сортовой решетке. В верхней графе этой решетки указаны характерные для данного сорта типы спектров, а в нижней - частота их встречаемости в процентах (табл. 6).

Применение предлагаемого способа в селекции сахарной свеклы дает возможность четко гадентифицировать сорта по частоте

встречаемости электрофоретических спектров глобулинов в выборке 100 семян. Способ позволяет наряду с идентификацией изучать генетическую структуру популяции, оп- ределять оригинальность и константность сорта.

Формула изобретения

Q Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включаюший электрофорез белковой вытяжки семян без околоплодника и после- дуюш,ий анализ полученных электрофоретических спектров, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и надежности

5 идентификации, электрофорезу подвергают глобулины отдельного семени, которые выделяют методом криопреципитации, при этом перед электрофорезом в белковую вытяжку вводят два дезагрегирующих агента - до- децилсульфат натрия и 2-меркаптоэтанол.

Таблица 1

Изобретение относится к биохи.мичес- ким способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, фор.м и сортов, изучения их генетической структуры. Цель изобретения - повышение точности и надежности идентификации. Отбирают семена без околоп.тодника. Каждое семя помещают в пробирку и экстрагируют суммарные белки. Затем из белкового экстракта методом крио- преципитации выделяют глобулины, которые фракционируют с помощью электрофореза. Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента (1°/о додецилсульфата натрия и 5% 2-меркапто- этанола), и электрофорез осуществляют в вертикальных пластинах. 2 ил., 6 табл. о & (Л

16

Диффузное проявление 6 компонентов

Число электрофоретческих компонентов

Не проявляющиеся компоненты (Rf)

23

Четкое проявление всех компонентов

Таблица 2

1 1619 23

0,020,10 0,100,18 0,180,230,26 0,260,370,70 23

21 17

0,87 0,73

0,92 0,76

0,96 0,78

0,82

0,87

0,92

0,96

Продолжение табл. 2

ПоказателиОбъем экстраги- Продолжительность Продолжительность

рующего буфера, экстракции, ч электрофореза, ч мл

0,1 I 0,2| 0,3 1 1 3 Гночь 3 Г 4 Г 7

Не разделившиеся

зоны (Rf)-- 0,42 --

0,64 ---0,64 Таблица 3

Компонент Относительная электрофоретическая подвижность компонентов глобулинов в электрофоретических спектрах (Rf)

Нативная сие- С применениемС примененитема геля - одного дезагре-ем двух дезизвестный гирующего аген-агрегирующих

способ та (SDS) -агентов (SDS

опробованноеи 2-меркапрешениетоэтанол) предлагаемыйспособ

0,03 0,09 0,13 0,20 0,28 0,48

0,02 0,10 0,18 0,22 0,24 0,28 0,34 0,40 0,42 0,46 0,48 0,52 0,54 0,58 0,62 0,68 0,70 0,73 0,76

Общее число компонентов

123 l 23

/

123 Г20

ХЛ

123

,

123

/

123

-л

123

123

/л

123

Ч

123

(1)23456

23456

(1)(2)(3)456

(1)23456

23456

(1)23456

(1)(2)(3)456

(1)(2)3456

(1)23456

(1)23456

23456

1463190

10 Продолжение табл. 3

12

23

Таблица 4

12356789 123(4)5678 123(4)5679 12356789

23(4)567(8)9

1 2356789 235679 235679

8910 Ш3)5789 1235679 123457

Индустри- альньй

Таблица 5

Примечание. НСР 0,05 для сравнения частных средних 0,136.

Частота встречаемости, %

14,70 5,90 5,90 17,60 32,30 5,76 17,70

Спектр (сорт БЦ 45)

Частота встречаемости, J

15,57 6,70 4,40 4,40 13,30 35,60 13,30 6,77

Продолжение табл. 5

Таблица 6

10

11

W/

2

УУУ

%

/77

8 9 Ю 71

22

у

т.

77.

ZZ