Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур Советский патент 1991 года по МПК A01H1/04 G01N33/68 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно в овощеводстве, селекции и семеноводстве овощных культур.

Цель изобретения - повышение до-| стоверности и точности анализа.

Способ состоит в том, что проводят выделение изоферментов кислой фосфатазы из образца семян путем гомогенизации проростков в экстрагенте, электрофоретическое разделение выделенных изоферментов в полнакриламид- ном геле и их проявление, при этом обработку осуществляют в экстрагенте, включающем аскорбиновую кислоту 0,02-0,06 II, цистеин-НС 0,03 -, 0,07 М, этилендиаминтетраацетат натрия 0,02-0,06 II, в буфере, при рН

7,0-7,4 с последующим выдерживанием полученного гомогената при 2-6°С в течение 10-14 ч.

В этом случае достигается более высокое разрешение, чем в известном способе: обнаруживается более 10 изоферментов у разных представителей семейства крестоцветных, в то время jcaK при использовании известного cno-v соба-5-6.Повышение разрешающей спо- собности позволяет с большей достоверностью анализировать сорта, различать сходные генотипы.

Пример 1. Изоферменты кислой iфосфатазыiэкстрагируют из 48-часовых проростков представителен крестоцвет- М: трис-HCl буфером (рН 7,2), .содержащим 20% сахарозы, 0,04 11 аскорг

о со о

о

СО

10

20

25

биновой кислоты, 0,05 М цистеина-НС1, 0,04 М ЭДТА-Ма2 (натриевая соль эти- лендиаминтетраацетата) и 5% Сефадекса . Экстракцию проводят в течение 12 ч при 4°С. Для электрофоретическо- . го анализа используют 15-20 мкл образца. Предварительно пробы центрифугируют при 16000 g в течение 30 мин. Электрофорез белков проводят в двухслойном геле: верхний (концентрирующий) содержит 5% акриламида, а нижний (разделяющий) - 7,5%. В концентрирующем геле весовое соотношение акриламида к N,N -метиленбиакриламину 15 составляет 20:1, а в разделяющем - 20:2. Для приготовления гелей используют следующие растворы: а) 20%-ный акриламид: акриламид 47,5 г; N,N/- j-метиленбисакриламид 2,5 г; акрил- амид 4. N,N -метиленбисакриламид 5 г; объем доводят водой до 250 мл; б) трис-ЭДТА-боратный буфер (рН 8,0); трис-107,5 г, ЭДТА-Na - 9 г, борная кислота - 5,5 г; объем доводят водой до 1 л. Концентрирующий гель состоит из 30 мл раствора акриламида (реагент а), 8 мл трис-ЭДТА- боратногог буфера (реагент б), 0,08 мл ТЕМЕДа (N,N,N -N -тетраме- тилендиамин), 60 мг персульфата аммо - .ния и 42 мл воды. Разделяющий гель состоит из 7,5 мл раствора акрилами- да (реагент а), 3 мл трис-ЭДТА- боратного .буфера (реагент б), 0,03 мл ТЕМЕДа, 30 мг персульфата ам- мокия и 19, 5 мл воды. Размеры геля составляют 170x75x3 мм . Одновременно анализируют 30 образцов. Перед электрофорезом проводят преэлектрофорез при градиенте потенциала 26 В/см в течение 30 мин. В качестве электродного раствора используют трис-ЭДТА- боратный буфер (реагент б), разбавленный водой в 10 раз. Электрофорез проводят в трчение 2,5 ч при градиенте потенциала 40 В/см при 8 С. Окрашивание изоферментов кислой фос- фатазы проводят прочным синим (RR- -соль) Cjell NjOj, . Окрашивающий раствор содержит 100 мг сЈ-нафтилфос- фата (Na-соль), 1 г поливинилпирро- лидона К 25 (М 2400 г/моль), 200 мг прочного синего (RR-соль), 40 мл 0,25 М Na-ацетатного буфера (рН 5,0) и 200 мл воды. После окончания электрофореза гель промывают водой и хранят в 7%-ном растворе уксусной кислоты.

16307034

Остальные примеры проводят ана- -логично примеру 1, используя другое количество компонентов экстрагента и на различных сортах и видах крес- 7 тоцветных. Результаты представлены в табл.1-6.

В табл. 1 и 2 представлены результаты контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур, полученные согласно предлагаемому способу; в табл.3-6 - данные, полученные при различных значениях концентрации компонентов экстрагирующего буфера. Как следует из табл.1 и 2, различные сорта представителей семейства крестоцветных характеризуются специфическим спектром изоферментов кислой фосфатазы, что не достигается при использовании известного способа (таб.3 и 4). Предлагаемый способ позволяет обнаружить межсортовые различия (табл.1), а также гетерогенность ряда исследованных сортов (табл.2). Из табл.3-6 следует, что при выходе за пределы отмеченных значений концентраций компонентов экстрагирующего буфера и температуры эффект не достигается.

Как видно из табл.3,уменьшение концентрации компонентов экстрагента приводит к уменьшению числа выявляемых изоформ кисдой фосфатазы, к исчезновению отдельных компонентов и появлению других, одновременно снижается стабильность получаемых результатов. Повышение концентрации компонентов экстрагента отрицательно сказывается на качестве электрофор еграмм. Оптимальные условия эксперимента достигаются при следующих концентрациях компонентов экстрагента (М): аскорбиновой кислоты - 0,02 - 0,06; цистеина-НС1 - 0,03-0,07; 45 ЭДТА-Na - 0,02-0,06.

Как видно из табл.4, при уменьшении рН экстрагирующего буфера ни- Гже 7,0 не экстрагируются два наиболее подвижных компонента спектра, а при повышении рН выше 7,4 - три наименее подвижных компонента кислой фосфатазы.

Как видно из табл.5, при повышении температуры экстракции за преде- сс лы на электрофореграмме исчезают ; компоненты с Rf 0,12 и 0,20. При

снижении температуры ниже 2° С экст-- ракт замерзает и становится непригодным для электрофоретического анализа.

30

35

40

50

10

Как видно из табл.6, при уменьшении времени экстракции на электрофо- реграмме не выявляются компоненты с высокой электроферетической подвижностью (компоненты 8-10). При увеличении времени экстракции (более 14 ч) зоны изоферментов становятся диффузными, вероятно за счет эндогенного протеолиза.

В настоящее время контроль сорто- яой чистоты ведется на основе анализа морфологических признаков. В СССР для определенной сортовой чистоты и видимой принадлежности семян капусты, редиса и редьки используют грунтовый контроль. Однако это требует значительных затрат времени и средств, причем идентификация сортов по морфологическим признакам часто бывает затруднительной. Предлагаемый способ, основанный на изучении изофермент- ньк систем, является более точным, поскольку слектр изоферментов, в частности кислой фосфатазы, в отличие

15

20

25

ным признаком и не зависит от условий выращивания. В СССР и за рубеже проверка сортовой чистоты перекрест ноопыляющихся растений не разработа

Формула изобретения Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур, включа щий выделение изоферментов кислой фосфатазы из образца семян путем гомогенизации проростков в экстраге те, электрофоретическое разделение выделенных изоферментов в полиакрил амндном геле с получением электрофо ретических спектров и их последующи анализ, отл и, чающийся тем, что, с целью повышения точност и достоверности анализа, для выделе ния изоферментов используют экстра- гент, включающий аскорбиновую кисло ту 0,02-0,06 И, цистеин-НС1 - 0,03 0,07 М, этилендиаминтетраацетат нат рия 0,02-0,06 М, при рН 7,0-7,4, при этом полученный гомогенат выдер

/УГ морфологических, является стабиль- живают при 2-6°С в течение 10-14 ч.

1630703

0

5

0

5

ным признаком и не зависит от условий выращивания. В СССР и за рубежей проверка сортовой чистоты перекрестноопыляющихся растений не разработана.

Формула изобретения Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур, включающий выделение изоферментов кислой фосфатазы из образца семян путем гомогенизации проростков в экстраген- те, электрофоретическое разделение выделенных изоферментов в полиакрил- амндном геле с получением электрофо- ретических спектров и их последующий анализ, отл и, чающийся тем, что, с целью повышения точности и достоверности анализа, для выделения изоферментов используют экстра- гент, включающий аскорбиновую кислоту 0,02-0,06 И, цистеин-НС1 - 0,03 - 0,07 М, этилендиаминтетраацетат нат1- рия 0,02-0,06 М, при рН 7,0-7,4, при этом полученный гомогенат выдерживают при 2-6°С в течение 10-14 ч.

Изобретение относится к биотехнологии и касается идентификации сор тов крестоцветных культур, которая необходима при селекции и семеноводстве, а также в овощеводстве. Целью изобретения является повышение достоверности и точности анализа. Способ состоит в том, что выделяют изофер- менты кислой фосфатазы из образцов семян путем гомогенизации проростков в экстрагенте, содержащем аскорбино- зую кислоту, цистеин-HCl, этиленди- аминтетраацетат натрия, после чего проводят их электрофоретическое раз- д ление и по полученным спектрам изоферментов осуществляют контроль сортовой чистоты. 6 табл. I (Л с

Т а б л н д а

Относительная подвижность (Rf) в ПААГ изоферментов кислой фосфатаэы разных сортов представителей сем. Brassiciceae -

Таблица

Относительная подвижность изоферментов кислой фосфатазы гомогенных и гетерогенных сортоп сем. Brassicaceae

Та 6 л и ч а

Относительная подвижность (Rf) в ПААГ изоферментов кислой фосфатаэы капусты брюссельской при. различных концентрациях компонентов экстрагирующего буфера

Относительная подвижность (Rf) в ПАЛГ иэоферментов кислой фосфатазы капусты брюссельской при различных значениях рН экстрагирующего буфера

Относительная подвижность (Rf) в ПААГ иэофермеятоа кислой фосфатазы капусты брюссельской при различной температуре экстракций

Относительная подвижность (Rf) в ПААГ нэофернентов кислой фосфатазы капусты брюссельской при различном временя экстракции

Т а в л и ц в 4

Таблица 5

Т а в л в ц 6