Способ проведения иммуноанализа Советский патент 1990 года по МПК G01N33/58 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что в качестве люминесцирующих металлопорфиринов используют металлопорфирины, обладающие свойством замедленной флуоресценции; при этом возбуждение светом проводят в длинноволновой полосе поглощения металлопорфиринов, а измерение уровня замедленной флуоресценции связавшегося метал- лопорфирина ведут в диапазоне длин волн максимума флуоресценции.

Пример 1. Исследуемую про- бу с диагностируемым объектом - клетками Alcaligenus faecalis в концентрации 1 млн микробных тел/мл обрабатывают гомологичными антителами к Alcaligenus faecalis, приготовленными из сыворотки крови кролика. Антитела, мечены А1(ОН)-копропорфирином- III в соотношении белок/порфирин 1/1 (М). Параллельно проводят обработку исследуемой пробы гетерологич- - ными антителами, меченными А1(ОН)- копропорфирином. Обработку проводят добавлением в пробирки с пробой по 1 мл гомологичных и гетерологичных антител в концентрации 1 мкг/мл. Опытную и

%

Јь ГО

контрольную пробирки затем освобождают от несвязавшихся меченых антител центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадок сливают, а осадок промывают изотоническим расвором, повторяя операцию центрифугирования, и ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия. Зате дополнительно в раствор вводят кис- лородсвязывающий реагент - сульфит натрия в концентрации 3 мг/мл.

1 Параллельно проводят аналогичный эксперимент, в котором используют гомологичные и гетерологичные анти- тела, меченные Pd (2+)-копропорфири- нЬм (прототип).

Регистрацию уровня сигнала опытной и контрольной проб осуществляют н спектрофлуориметре LS-5 фирмы Pbrkin Elmer. Временная задержка между актом .возбуждения и приемом излучения - 1 мс.

а) Режим измерения замедленной флуоресценции А1(ОН) -копропорфирина длина волны возбуждения 570 нм (длинноволновая полоса поглощения); ре- г страция при длине волны 578 нм. Превышение сигнала опытной пробы (380 отн.ед.) над контрольной (40 отн.ед.) в 9,5 раз свидетельствует о наличии определяемого микроорганизма в пробе.

б) Регистрацию фосфоресценции Pd (2+)-копропорфирина (прототип) при длине волны 670 нм осуществляют при возбуждении светом с длиной волны 395 нм (полоса Сорэ). Сигнал опытной пробы 1300 отн.ед., контроль

0

5

0

5

0

ной - 350 отн.ед. Числовое соотношение опыт/контроль 1300/350 равно 3,7.

Пример 2. В лунки полисти- рольного микропланшета для иммуно- ферментного анализа (Dynatech, США) адсорбируют антитела к определяемому антигену: заливают в каждую лунку по 0,2 мл антител (10 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,1), инкубируют 1 ч при 37 С и ночь при k С. Затем раствор сливают и промывают лунки буфером ФСБТ (физраствор, рН 7,4, содержащий 0,1% тритона Х-100).

Заливают в 2 ряда лунок (опыт и контроль) по 0,2 мл стандартных растворов антигена из Pseudornonas auro- ginosa (1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; О мкг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем сливают растворы, промывают лунки 3 раза ФСБТ, заливают во все лунки 1 ряда антитела, ме- ченные А1 (ОН)-копропорфирином (20 мкг/мл в ФСБТ), а в лунки второго ряда - антитела, меченные Pd-копро- порфирином (20 мкг/мл). После 1-часовой инкубации при 37°С растворы сливают, промывают лунки ФСБТ, заливают по 0,2 мл десорбирующего раствора (3 мМ ЦТАБ). Затем добавляют в лунки кислородсвязывающий агент сульфит натрия (5 мг/мл), переносят растворы в измерительные кюветы на 0,5 мл и регистрируют замедленную флуоресценцию А1(ОН)-копропорфирина и фосфоресценцию Pd-копропорфирина в условиях, описанных fc примере 1. Результаты приведены в таблице. Чувствительность способа - 0,12 мкг/мл, выше, чем чувствительность способа- прототипа (0,25 кг/мл).

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа. Цель изобретения - увеличение чувствительности способа. Это достигается за счет того, что используются металлопорфирины, способные при ковалентном мечении белков резко увеличивать уровень замедленной флуоресценции, спектрально совпадающей с обычной флуоресценцией. Это дает возможность, возбуждая флуоресценцию металлопорфиринов в длинноволновой полосе поглощения и регистрируя свечение в той же спектральной области, минимизировать фоновое влияние фосфоресцирующих примесей, присутствующих в анализируемом образце и в материале кюветы. 1 табл.

Концентрация антигена 1 0,5 0,25 0,12 I 0,06 О